5种重要猪病病毒基因芯片探针建立及其初步应用.pdfVIP

5种重要猪病病毒基因芯片探针的 建立及其初步应用 陈微晶z 符 芳1 蔡雪辉1 田志军， 宋淑萍1 李 曦· 1．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室 猪传染病研究室，黑龙江，哈尔滨，150001 2．黑龙江省八一农垦大学，黑龙江，大庆，1631109 摘要 本研究将猪呼吸与繁殖综合征病毒(Porcine and reproductiverespiratorysyn— drome，PRRSV)、猪瘟病毒(Classicalswinefever virus，CSFV)、猪细小病毒(Porcineparvo— circovirus virus，PPV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)、2型猪圆环病毒(Porcine 2，PCV一2)5种病毒核酸的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上，以5种 Type 细胞培养毒的核酸作为模板，进行不对称PCR扩增，制备靶物，经绿色荧光染料Cy3标记后， 示，芯片探针可以分别特异地与Cy3标记的5种特异靶物结合。应用本研究制备的基因芯片 对100份现地采集的猪全血样品进行检测，其中，PRRSV阳性样品26份，PCV一2阳性样品47 FV检测阳性样品20份。表明，本研究设计并点制的cDNA芯片可以特异的检出5种病毒， 具有明确的、潜在的诊断应用性。 关键词 基因芯片；探针；PRRSV；PCV一2；PPV；PRV；CSFV 随着养猪业的发展，多种细菌、病毒等传染性病 验室保存，其序列在GENEBANK登录号为 原微生物广泛流行于猪群当中，给猪养殖业带来极 大危害。且近年来，现地呈现多种病原混合感 院哈尔滨兽医研究所的疫苗株CHl一a株、猪瘟兔化 染”“。，很难依据临床、病理解剖上表现出的病变对 疫病进行准确诊断，实验室诊断对于疫病诊断就显 得尤为重要。目前，实验室诊断病原的方法主要有 胞中、PPV接种子猪肾原代细胞中、PRV接种于单 病毒分离、ELISA、免疫荧光、PCR等”’’，虽然可以 层的鸡胚成纤维细胞中，37℃、5％CO：培养箱培养 对1个或同时对几个病原做出诊断，但是，难以满足 (Heraeus，Inc．)。 对大量的样品进行平行检测或对现地呈现的高度复 2．DNA提取取106 PCV一2、PRV、 TCID5。／ml 杂的多病原感染进行全面诊断。基因芯片技术自应 PPV细胞毒各500t_￡l，分别加入25“l10％SDS、5耻l 用于病原的诊断后”…，其高通量特点弥补了其他检 测方法的不足，可以通过建立基因芯片探针，在一个 平台上、一次检测中对大量的样品进行感染病原 次于4℃，12000rpm离心15min，取上清，加等体积 诊断。 本研究应用基阕芯片技术，将大小在100bp左20～30 右的、特异的cDNA片段作为基因探针，点制于氨 基玻片上，制备PRRSV、PCV-2、PPV、PRV、CSFV解，储存于一20℃备用。 5种重要猪病病原的基因检测芯片，检验基因芯片 3．RNA提取及cDNA制备取106TCID50／ml 的特异性，并初步应用于现地样品的检测。 LS 材料与方法 毒RNA。将提取的vRNA进行反转录，反应总体 1．病毒培养PCV一2—871、PPV病毒株为本实