鲤脑组织低温差异表达候选基因筛选.pdfVIP

鲤脑组织低温差异表达候选基因的筛选 徐丽华“2，常玉梅1，刘春雷。2，梁利群1，刘金亮“2 1．中国水产科学院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨150070；2．上海海洋大学)炉与生命学院， 上海201306 关键词：鲤；脑组织cDNA；低温；候选基因；实时荧光定量PCR；双标准曲线法 引言 淡水鱼类的低温耐受性问题一直是鱼类遗传和育种学家潜心研究的难题，至今对鱼类耐低温的 机理了解得还不清楚。鉴于在温度发生变化的过程中，脑部是神经中枢，同时也是参与体温调节的 重要组织，其中的基因表达变化通常是最快、最灵敏的。因此本研究以具有耐低温性状的黑龙江鲤 rerio为实验对象，采用荧光相对定量PCR法，从 carpio及不具有耐低温性状的斑马鱼Danio Cyprinus 基因表达水平上筛选冷诱导条件下脑部差异表达的候选基因。 材料方法 挑选健康、大小均一的1龄黑龙江鲤，随机分成两组，常温对照组(23℃)和低温待测组(6℃)， 每组6尾，两组鱼同时处理10d后，采取鱼脑组织提取RNA并反转录成cDNA模板。收集下载报道的 鲤脑低温差异表达的EST序列，查阅与动、植物耐低温有关的文献，从神经调节、信号传递、膜脂 膜蛋白、不饱和脂肪酸及血液代谢5个方面挑选候选基因，根据EST序列设计并初步筛选引物后，应 用双标准曲线相对定量PCR法检测出在对照组和实验组中表达量有显著差异的基因。然后将鲤低温 高表达的基因与斑马鱼的NCBI数据库进行同源比对，再以同源的斑马鱼EST序列设计引物，同样将 斑马鱼设计对照组(23℃)和低温待测组(10℃)，提取斑马鱼脑组织总RNA并反转录后，用同样 的方法进行定量。通过比较耐低温鲤鱼和不耐低温斑马鱼的定量结果，筛选与鱼类耐低温性状相关 的候选基因。 结果 以反转录的cDNA为模板，经PCR筛选，最终确定50个候选基因中有26个候选基因的引物扩增条 带清晰、唯一，以18SrRNA为内参基因，检钡IJ26个候选基因的相对表达量。实验数据经显著性分析， 发现有5个候选基因在低温条件下表达量显著上升(P0．01)，与对照组相比它们的表达量分别上升 同源比对，发现其中4个候选基因均与斑马鱼同源。仍以18SrRNA为内参基因，检测上述4个候选基 因在斑马鱼脑组织中的表达差异。斑马鱼定量结果表明低温条件下4个基因的表达量分别是常温对照 组的0．76倍，1．62倍，1．36倍和1．05倍，表达量差异不显著(P0．05)。 讨论 鲤鱼及斑马鱼定量实验结果表明，低温条件下有5个候选基因在耐低温的黑龙江鲤脑组织中表达 量显著上升，而在不耐低温的斑马鱼脑组织中的表达量上升不显著，说明上述5个基因很有可能与鱼 类耐低温性状密切相关。基因功能比对结果表明5个基因编码蛋白产物分别是脂肪酸链延伸蛋白、酰 基辅酶A脱氢酶、转录起始因子IIB、肌醇．1．磷酸合成酶和血脑屏障HT7抗原。根据其各自参与的机 体代谢功能推测，低温条件诱导鲤鱼某些基因的表达，通过加强不饱和脂肪酸代谢活动，神经系统 调节作用，细胞转录活动及脑部细胞内外的物质运输及交换作用，以达到对冷环境的适应。黑龙江 鲤可以耐受0～4℃的低温长达6个月，可能正是这些调节活动相互联系，相辅相成的结果。上述低 温下表达量显著上升的5个冷诱导候选基因的获得为今后进行不耐低温鱼类的基因工程育种提供了 基因元件。 致谢 所基本科研业务费专项资金项目(2009HSYZX．SJ．05)共同资助。 170