超低温保存苹果离体茎尖.pdfVIP

126 超低温保存苹果离体茎尖 赵艳华吴永杰 (河北省农林科学院昌黎果树研究所，河北果树无病毒苗木研究实验室，河jE昌黎066600) 提要本文论述了超低温保存技术的重要性，总结了所在实验室在苹果离体茎尖保存方 ●● 面的研究成果，提出了超低温保存苹果离体茎尖的较好方法。 关键词超低温；苹果；离体茎尖 以无性系为主的果树植物种质最常用的保存方法是在田问建立资源踊，利用这种方法 占地广、需工多，成本高且容易遭受自然灾害的侵袭。随着生物技术的发展，以正常室温和 最低限生长环境的离体保存有所应用，但这种方法存在着遗传稳定性和频繁继代等问题。 19印年，sa妇等首先证明了桑越冬芽经液氮保存后可以存活，接着又报道了苹果、梨、醋栗 等越冬芽超低温保存的成功。在国内，1987年简令成等以醋粟、柳、猕猴桃及桑越冬芽为试 材进行研究，获得了成功¨．23一J。但这种方法液氮耗量多，相应对库容要求大，离体培养时 污染极难解决，保存率低而不稳。Niino等以苹果为试材肯定了茎尖是理想的种质超低温保 存材料，研究仅限于经典试材．未能确定简单有效、适宜范围广的超低温保存方法【3．4J。针 对这些问题，我们开展了苹果离体茎尖超低温保存的研究。 ● l极慢速降温法 此方法是使植物材料在保护剂中以极慢的降温速率降温到一40℃，停留一段时间，细胞 达到充分的保护性脱水，再进行超低温保存。我们以金冠、富士为试材进行了研究，结果表 明，随降温速率的降低(O．1℃份)．．超低温保存后茎尖存活率显著提高，金冠由30％提高到 90％，富士也由O提高到45％以上。这说明在苹果茎尖冰冻过程中，降温速度越慢，脱水效 果越好。从而避免了细胞内结冰。试验还认为，培养时间对存活率影响很大，培养时间越长， 茎尖存活率越高，所试品种的趋势完全一致。培养70天同培养35天的茎尖相比较，超低温 保存后的存活率提高了50％。139％；低温锻炼能增强耐冰冻的能力，已被许多研究者所证 实。我们对苹果茎尖的试验表明，2℃低温锻炼可显著地提高茎尖的存活率，且随低温锻炼 时问的延长，存活率显著提高。两个鼯种表现出同样的趋势，低温锻炼38天后，金冠品种 的存活率由38．9％提高到90％以上，富士品种也由15％提高到80％；离体培养物的超低温 保存大多使用冰冻保护剂，使用种类及浓度因植物材料不同而异。我们认为，在苹果茎尖超 ■ 低温保存中，必须有冰冻保护剂存在，以5％二甲亚砜与5％甘油效果最好。试验所用的4 个苹果品种超低温保存后，茎尖存活率均达55％以上，此方法虽然在苹果茎尖的超低温上 获得了较理想的结果，但需要程序降温仪，操作繁琐且耗时长∞】。 127 瞄 2玻璃化法 玻璃化法是植物材料连同玻璃化保护剂以极其迅速的降温速率降温，使细胞内的水来 不及形成冰，就成为“完全玻璃化态”，水分子没有发生重新排列，不产生体积与结构的变化， 因而不会对细胞造成损伤。试验的成功很大程度上取决于材料的生理状态以及采用的冰冻 保护荆。选用离体培养的金冠、惠丰、王林，对玻璃化保护剂的种类、培养时间等影响因子进 行了研究，结果发现用P、_沿(50％蔗糖+50％甘油)处理苹果茎尖最好，3个苹果品种的存活 二甲基亚砜)处理苹果、梨、苜蓿等效果最佳，我们认为PvS3存活率高、组成简单，不存在二 甲亚砜，对茎尖无毒害作用；在研究中进一步证实了培养时间可以影响超低温保存后存活率 的观点，与培养20天的材料相比，培养70天的金冠和惠丰、王林的存活率由O提高到75％ 和60％；此方法用于5个苹果品种，存活率均达55％以上【6j。 3包埋干燥法 此方法与极慢速降温法的区别是通过茎尖预培养过程中逐渐提高蔗糖浓度等方法降低 细