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关于基因治疗载体的选择的一点看法-遗传学实验技术[1/2] 时间：2010-01-08 08:55:37??来源：生物教师??作者：生物教师 关键字：病毒 ,干细胞 ,载体 ,转基因 ,逆转录。Treat a bit view of the choice of carrier about gene 本文简介：關于基因治療載體的選擇的一點看法 。1.1 腺病毒载体腺病毒是较早用来转基因的一种载体，它对人体无致病性，生物安全性好；它的宿主范围广，而且可以感染静止细胞（如造血干细胞）。但早期以腺病毒为载体转导造血干细胞的转基因效率很低。腺病毒在进入宿主细胞后，其病毒DNA并不整合到宿主基因组上，是造成转基因效率 1.1 腺病毒载体15%的细胞表面有CAR表达，更早期的造血干细胞CAR表达更少。针对这一问题，Shayakhmetov等[4]以腺病毒为基础制成一种嵌合体载体，这一新型载体衣壳表达的短轴Ad35纤维蛋白可以结合到造血干细胞表面的另一种表达较多的受体上，从而提高了转导率。另有报道腺病毒与多聚阳离子的复合物也可高效转导造血干细胞。由此可见，对腺病毒载体的改造和转导介质的适当添加可以提高转导率，从而为腺病毒载体在造血干细胞转基因的应用开辟新的前景。(腺病毒是较早用来转基因的一种载体，它对人体无致病性，生物安全性好；它的宿主范围广，而且可以感染静止细胞（如造血干细胞）。但早期以腺病毒为载体转导造血干细胞的转基因效率很低。腺病毒在进入宿主细胞后，其病毒DNA并不整合到宿主基因组上，是造成转基因效率低的原因之一。有研究发现在造血干细胞表面缺乏腺病毒的特异性受体，所以一度认为造血干细胞不是腺病毒的合适的靶细胞。个别报道通过提高腺病毒的滴度可在造血干细胞获得较高的转基因效率[2]，但是病毒滴度过高又会破坏造血干细胞，使转导效率降低，所以单纯提高病毒滴度并不是一个可行的方案。Karen等[3]通过在体外的腺病毒与造血干细胞的混合培养物中加入多种细胞因子，保护造血干细胞集落，提高了转导效率。对腺病毒的深入研究证实该病毒主要通过病毒衣壳纤维蛋白与宿主细胞表面的柯萨奇/腺病毒受体（CAR）的结合进入细胞。在CD34+细胞中只10%1.2 腺相关病毒腺相关病毒是在对腺病毒进行研究时发现的一种非致病性的细小病毒，其宿主范围与腺病毒类似，也可以感染非分裂期的细胞。腺相关病毒作为转基因载体的突出优点是它的DNA能够整合到宿主的基因组中，所以转入的外源基因相对稳定。虽然腺相关病毒对造血细胞的识别率较高，但对腺相关病毒成功转基因入造血干细胞的报道并不多。许多研究者发现重组腺相关病毒不能有效转导造血干细胞，通常需要高复合感染，并用多种细胞因子刺激才能获得长时效性。但是也有少数学者检测到腺相关病毒高效转入造血干细胞。Chatterjee等[5]就通过FISH观察到腺相关病毒稳定地整合在造血干细胞染色体组上，并长期存在。Nathwani等[6]认为在重组腺相关病毒的复杂制备过程中混入的野生型病毒和质粒可能影响了重组腺相关病毒的转导。因此他们采用特殊的包装质粒制备出高度纯化的重组腺相关病毒，部分提高了转导效率，但转入的基因仍不能长期存在。也有提出采用柱层析等方法提纯重组腺相关病毒。近来有学者观察到重组腺相关病毒可在宿主细胞核内以非整合形式存在，并推测这可能是造成对腺相关病毒载体转导效率报道不一的原因[7]。所以腺相关病毒是否适于作为造血干细胞转基因的载体，还需要进一步的研究。1.3 逆转录病毒载体目前认为转基因效果确切，应用也最为广泛的一种转基因载体是逆转录病毒载体，人们对它的研究也最为深入。逆转录病毒进入宿主细胞后，其基因组RNA逆转录为DNA后插入宿主基因组，因此转入的外源基因可以稳定存在。但是逆转录病毒只能转导分裂期的细胞，这对于转导造血干细胞的是一大障碍。为了提高造血干细胞的转基因效率，人们模仿体内造血环境，在体外培养物中加入干细胞因子、白介素等细胞因子刺激造血干细胞进入分裂期，从而促进逆转录病毒转导[8]。另外，通过在培养基中加入基质细胞，纤维连接素，Flt-3配体等也可以增加造血干细胞与病毒的接触机会，在一定程度上提高转导率[9]。在比较了不同添加物增加转导的能力之后，Williams[10]提出基质细胞和纤维连接素的作用可相互替代，不必重复加入，进一步简化了转导体系。另一些工作者则希望通过对病毒自身的改造来提高转导效率。Karneko等[11]将逆转录病毒的GCsap接上不同的病毒长末端重复序列（LTR）制成新的载体转导造血干细胞后移植到免疫缺陷的NOD/SCID小鼠模型观察转基因效率，发现连接鼠干细胞病毒的LRT的载体效率明显高于其他组。有的研究者分别用吉本猿白血病病毒(GoLMV)外壳和泡状口炎病毒（VAV-G）衣壳包装双嗜性病毒，