人TRAIL在Pichia表达系统中的重组表达.pdfVIP

5．人TRAlL在Pichia表达系统中的重组表达 王梁华 章亚南 朱玉平 娄永华 彭燕 冯煜 焦炳毕‘ 第二军医大学基础部分子毒理学教研室 上海200433 摘要TRAIL是肿瘤坏死因子家族新成员．本文在得到TRAIl，可溶性 分子编码序列的基础上进行了TRAIL的重组表达研究．将可溶性TRAIL基 3．5酵母表达载体，氯化锂转化酵母GSl15，甲醇谤导表达 因片断插A．pIC 5天．结果发现在酵母细胞中重组表达的TRAIL在SDS．PAGE上呈三聚体形 式，杀伤肿瘤细胞的比活性较原核重组表达复性后的TRAIL有明显提高， 说明TRAIL可能已正确折叠并形成活性必须的高级结构．用抗人TRAIL多 抗可以确认上述真核表达系统表达了TRAIL重组分子． 关键词TRAIL；Pichia表迭系统；抗肿瘤 necrosisfactor·related 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor 2 素一2配体(apoptosisreceptor 免疫调节和炎症反应，并发挥细胞毒作用，因而为世人所瞩目【3．4】。研究表明， 域形成同源三聚体的亚结构，而N末端15—40氨基酸为疏水区域并形成跨膜结 构，整个分子由281个氨基酸组成。目前发现人TRAIL的膜受体有5种：死亡受 体(death!eceptor，DR)4，DR5，及诱骗受体(decoyreceptor!，DcRl)或称无胞内 withoutanintracellular 区域受体(TRAILreceptor domain，TRID)。正常细胞可 表达上述3种受体，而肿瘤及转化细胞仅能表达DR4和DR5，或者是约高于正常 R4，TRuNDD一一另一种细胞内区域不完全的诱骗受体及OPG一个与调节 骨密度有关的受体Is,st。 我们在得到中国人TRAIL基因和原核表达的基础上f7】，将其基因插入甲 醇营养型酵母表达系统(Pichia)进行重组表达。结果得到了有活性的重组人 内抗肿瘤作用打下了基础。 一、材料与方法 1、引物合成 5 493 9 aobh日uninet．COm．c“ ‘通讯联系人，Tel＆Fax：021—636；E-raail：ji 322 GAATTCGGATCCACCATGGTTCAAGAAAAG 上游引物：5’．GG CAA C．3’(插入EcoRI、BamHI两个酶切位点，并加上Kozak保守序列和起始 密码子．黑体与编码TRAIL第103位氨基酸开始的序列互补)(P1)： TTA GAA CAG 下游引物：5’．CA TTgTCGAG阻GGT I、XhoI两个酶切位点，黑体与上述的重组质粒互补)(P2)。 2，PCR扩增 72℃10min，完成扩增反应。 3，定向克隆 3．5同样双酶切，胶 PCR产物纯化后用EeoRI、BamHI双酶切，质粒pIC 回收酶切片断，T4连接酶连接，转化大肠杆蕾，扩增，抽提质粒，鉴定，筛 出重组子。 4、TRAIL与pIC3．5重组质粒转化酵母茵 上述得到的含TRAIL基因的pIC3．5质粒大量扩增后按操作说明书转化甲醇 营养型酵母GSll5。简要步骤如下： (1)SalI酶切质粒以线性化，胶回收酶切片断以纯化质粒； (2)5000rpm离心5rain隔天接种于30℃5ml LiCl洗细胞一次，离心收集后备用： (3)担体鲱鱼精DNA煮沸10rain，骤冷至0C，配成2mg／ml浓度； IXl 50％PEG3350：36ul 1mol／