双低油菜品种华双3号幼叶全长cDNA文库的构建.pdfVIP

双低油菜品种华双3号幼叶全长 cDNA文库的构建 董海滨管荣展 江苏南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京210095 构建油菜cDNA文库对于油菜的基因克隆和基因功能鉴定具有十分重要的意义，已受 到学者们的普遍重视。ScottR．等(1991)利用油菜花蕾构建了孢子发生和小孢子发育的 cDNA文库，分别从这两个eDNA文库中分离得到了3个绒毡层特异cDNA和5个小孢子特 异eDNA。BarretP．(1998)等利用FAEI为探针从油菜未成熟胚cDNA文库中克隆了编码 长链脂肪酸合成酶基因(3一酰基酮一辅酶A合成酶)。MatthewJ．(1994)等从发育油菜种子 cDNA文库中筛选出了一个编码乙酰辅酶A结合蛋白的相应物。MuldinI．(1994)用拟南 芥chllcDNA为探针从氮处理的油菜根cDNA文库中筛选出一个编码氮运输蛋白的基因。 缩减杂交技术构建了甘蓝型油菜的缩减cDNA文库并通过筛选分离出与油菜叶片衰老有关 的基因。目前，国内以甘蓝型油菜为材料的cDNA文库构建研究报道还没有。本文以甘蓝 型双低油菜为材料，构建了全长cDNA文库，为油菜基因克隆和苗期发育的分子生物学研 究打基础，具有重要意义。 1材料与方法 1．1材料与试剂 取试验田种植的甘蓝型油菜品种华双3号l～3片真叶时的叶片为材料。采集时期： 从第一片真叶长出开始取材，每隔两天取一次材，直到第4片叶片长出为止。 mRNAMini 分离纯化，使用了德国Qiagen公司的OligotexKit；cDNA文库构建，使用了美 cDNA 国Clontech公司SMARTConstruction Library Kit；包装蛋白采用美国Stratagene公司的 GigapachⅢGoldPackagingExtract；其他化学试剂均购自南京生兴生物技术有限公司。 玻璃器皿洗净后于180℃烘烤6小时，塑料器皿均以o．1％的DEPC水37。(2浸泡12小 时后，然后高温高压灭菌并于70～80℃烘烤干燥。 1．2方法 总RNA的提取：迅速取约0．19新鲜的油菜叶片置于研钵中，加液氮研磨至细粉状， 然后提取总RNA，并用分光光度计测量RNA的含量和纯度，1，1％琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性。 双低油菜品种华双3号幼叶全长eDNA文库的构建 351 0009离心30分钟，弃上清， 倍体积，(一20。C)无水乙醇，一800C过夜。第二天4℃，14 再用75％乙醇洗涤沉淀，7 5009离心5分钟，弃上清，沉淀晾干后溶解于6出DEPC— H20中。 W HI／3／PCRPrimer和SMART mRNA用CDS Oligonucleotide cDNA文库的构建：取3ta Primer通过PCR合成ds 反转录合成cDNA第一条链，再用5／PCRprimer和CDSIll／3／PGR cDNA，合成ds SPIN400 cDNA经蛋白酶K消化，s6I酶切后，经CHROMA 脂糖凝胶上电泳检测。将ds 进行包装反应。 滴度与重组率测定以及文库的扩增：用1×^稀释缓冲液以1：5，1：10，1：20的比例稀 LB／MgS04平板上，使顶层琼脂均匀 50taX一斛)，混匀并快速倒在已经37℃预热的90mm 分布，室温冷