磷酸钠协同转运蛋白基因SLC34A2的真核表达重组载体的构建和鉴定.docVIP

磷酸钠协同转运蛋白基因SLC34A2的真核表达重组载体的构建及鉴定 　　作者：张越 杨洋 安继红 乔俊华 吴春风 于红霞 马忠森 作者单位：吉林大学第二医院呼吸内科，吉林 长春 130041 　　【摘要】 目的 构建磷酸钠协同转运蛋白基因SLC34A2的真核表达重组载体pcDNA3.1(+)，并进行酶切鉴定。方法 查得人SLC34A2 cDNA全序列，设计合成相应特异性引物，引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，通过RT-PCR获得SLC34A2基因，定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中，构建重组体pcDNA3.1(+)-SLC34A2，通过酶切分析，PCR及测序鉴定，筛选阳性重组体。结果 从正常肺组织中逆转录扩增出的SLC34A2基因，大小约为2 073 bp，经双酶切及测序鉴定证明成功构建了SLC34A2真核表达重组载体pcDNA3.1(+)-SLC34A2。结论 RT-PCR 扩增得到了大小约为2 073 bp 的SLC34A2基因;并成功构建了pcDNA3.1(+)-SLC34A2 真核表达重组载体。 　　【关键词】 磷酸钠协同转运蛋白;基因SLC34A2;真核表达重组载体 　　SLC34A2是编码磷酸钠协同转运蛋白的基因，表达在人体的多种组织中，以肺组织表达最高。该基因主要参与无机磷代谢，与肺泡微石症、睾丸微石症等多种代谢性疾病发病相关。目前对于这些疾病的治疗都没有很好的办法，SLC34A2基因是最近发现的此类疾病的致病基因〔1〕，克隆该基因并研究其在细胞钙、磷代谢中的功能，是治疗该类疾病的前提。但是尚无这方面的文献报道。因此，本研究采用RT-PCR 技术扩增SLC34A2基因，将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1 (+) 构建pcDNA3.1(+)-SLC34A2 真核表达重组载体，通过酶切分析、PCR 及测序鉴定，筛选阳性重组体，为研究该基因在细胞钙、磷代谢中的功能奠定实验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 质粒及菌株 大肠杆菌DH5a(DH5a E.coli)菌株、pcDNA3.1(+)真核表达载体购自天根公司，新鲜的肺组织取自本院胸外科手术中。 　　1.1.2 酶、分子量标准及试剂盒 Marker Ⅳ、BamHⅠ和EcoRⅠ内切酶购自天根公司，T4 连接试剂盒、DNA 回收试剂盒、Primer STAR DNA聚合酶购自TaKaRa公司。 　　1.1.3 引物设计与合成 参考Genbank 收录的SLC34A2序列，设计两条引物，上游P1：5′-GCGGATCCTAATGGCTCCCTGGCCTGAAT-3′，含BamHⅠ酶切位点，下游P2：5′-GCGAATTCCTACAAGGCCGTGCATTCG-3′，含EcoRⅠ酶切位点。上述引物由上海生工公司合成并纯化。 　　1.2 方法 　　1.2.1 组织总RNA的提取 Trizol试剂提取新鲜肺组织总RNA，经电泳检测及测定A260/A280比值，选取比值在2.0左右的RNA样本，按Fermentas公司试剂盒说明书逆转录合成cDNA第1链。总RNA 2 Μg，Oligo(dT)1 Μl，引物(0.5 Μg/Μl) 1 Μl，DEPC水补足12 Μl，瞬时离心后，70℃温育5 min，取出后立即冰浴，加入5×反应缓冲液4 Μl，RNA酶抑制剂(20 U/Μl)1 Μl,10 mmol/L dNTP 混合物 2 Μl，瞬时离心混匀，37℃温育5 min，取出置冰上，加入：逆转录酶RevertAid TMM-MuLV(200 U/Μl)1 Μl，总体积20 Μl，42℃温育60 min，之后70℃温育10 min终止反应。cDNA产物存于-20℃。 　　1.2.2 PCR 以制备好的cDNA为模板，采用引物P1,P2扩增目的片断。反应条件：94℃3 min，98℃10 s，68℃8 min，72℃ 2 min,共30个循环，末次延伸8 min。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。 　　PCR扩增产物以2% 琼脂糖凝胶电泳检测发现明显阳性扩增条带后，切下含目的基因的凝胶块，放入一洁净1.5 ml Ep管中，按Tiangen公司小量胶回收试剂盒说明书进行PCR扩增产物的胶回收纯化，纯化后的产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果。 　　1.2.3 质粒载体和PCR 产物的酶切和纯化 分别以BamHⅠ和EcoRⅠ双切PCR产物和pcDNA3.1，酶切体系为：10×缓冲液4 Μl，PCR产物 (pcDNA3.1)3 Μl，BamHⅠ和EcoRⅠ各0.5 Μl，补足双蒸水至20 Μl。37℃过夜后胶回收酶切产物。