GILZ真核表达载体的构建及其表达定位.pdfVIP

· 618 · 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2009，25(3)：61二 [文章编号] 1000—4718(2009)03—0618—04 · 实验技术 · GILZ真核表达载体的构建及其表达定位 王毅飞 ， 邢飞跃 ， 蔡德鸿 ， 陈 宏 ， 莫永炎 ， 伊 娜 (。南方医科大学珠江医院内分泌科，广东广州510282；暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫中心，广东广州510632； 南方医科大学病理生理教研室，广东 广州 510515；广州市中医院内分泌科，广东 广州510130) [摘 要] 目的：克隆、构建 HA标签的糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白GILZ表达载体 ，观察其在细胞中表 达与定位，为研究GIIZ在脂肪细胞分化中的作用提供工具。方法：采用逆转录PCR(RT—PCR)法从C3H10T1／2细 胞中扩增带有HA标签的GILZcDNA编码区，并将其重组于真核表达载体pcDNA3中。经酶切、序列鉴定分析后， 将该重组质粒通过Lipofectamine2000脂质体和CaC1：方法，分别转染C3H10T1／2和293T细胞，用HA抗体免疫荧 光和免疫印迹法检测GILZ在细胞内的表达、分布及分子量大小。结果：HA—GILZ表达载体经酶切鉴定和测序分 析确认构建成功，并在C3H10T1／2和293T细胞中获得了高效表达。在荧光显微镜下，GILZ主要表达于细胞质内， 分子量约2OkD。结论：成功构建 HA—GILZ基因表达载体并表达于 C3H10T1／2细胞质中，为GILZ的功能研究奠 定了基础。 [关键词] 糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白；C3H10T1／2细胞；真核表达载体 [KEYWORDS] Glucocorticoidinducedleucinezipper；C3H10T1／2cells；Eukaryoticexpressionvector [中图分类号] R318．15 [文献标识码] A 脂肪组织(adiposetissue)不仅是哺乳动物体 内重要的能 Lipofectamine2000脂质体 (Invitrogen)，小牛血清 (Hy— 量贮库和赋形组织，而且还是多种激素类物质分泌的内分泌 clone)，DMEM(Hyclone)，HA单抗 (Sigma)，羊抗鼠IRDye800 器官；脂肪细胞 (adipocytes)分化与调控失常可导致人类多种 Ⅱ抗 (LI—COR)，羊抗 鼠一CY3Ⅱ抗 (Zymed)，SlowFade(In— 疾病如肥胖症、2型糖尿病、脂肪肝、高脂血症及乳腺癌 vitrogen)，MMuLVRT／PCR试剂盒、质粒抽提试剂盒、Taq聚 等 j。因此，在细胞和分子水平上对脂肪细胞分化调控机 合酶、T4DNA连接酶、限制性 内切酶XhoI、BamH I、DNA 制研究 ，对探讨上述重大生命和疾病过程、上述疾病的预防 marker、蛋 白marker及非溶胶型 DNA回收试剂盒 (广州易超 与治疗具有重要理论和实践意义。 科技公司)，琼脂糖和LB培养基 (LifeTechnology)，测序和引 糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白(glueocorticoidinduced 物合成 由广州市易超医学试剂科技有限公司完成，pcDNA3 leucinezipper，GILZ)最先作为一种对地塞米松 (dexametha— 表达质粒、C3H10T1／2细胞、BL21(DE3)感受态 (本室保存)。 sone，DEX)敏感的基因而从胸腺细胞 DNA消减文库中分离 其它试剂为国产分析纯。 出来 J。根据蛋白的模体 (motif)分析，GILZ是一种新的亮 2 方法 氨酸拉链蛋 白，属于TGF—B刺激克隆一22(TGF—B—stimu— 2．1 细胞培养 C3H10T1／2细胞按常规在含 10％小牛血清 latedclone一22，TSC一22)转录因子家族 J。已有研究表明， 的DMEM培养基中培养。 GILZ具有炎症抑制、上皮细胞钠通道的调节等多项作用 2．2 GIIZ 的RT—PCR克隆 取约 l0 个 C3H10T1／2细胞 ， 外 。J，还可