HSPgp96诱导巨噬细胞呼吸爆发与细胞内外游离钙关系的研究.pdfVIP

维普资讯 电国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2008，24(2)：393—395、398 · 393 · [文章编号] 1000—4718(2008)02—0393—04 HSPgp96诱导巨噬细胞呼吸爆发与细胞 内外游离钙关系的研究 周欣阳。， 施海燕 ， 张天一。， 顾君一。 (南通大学 神经再生重点实验室，基础医学院病理生理教研室 ，江苏 南通 226001) [摘 要] 目的：探讨从小 鼠H 肝癌细胞 中提纯 的热休克蛋 白gp96(HSPgp96)对小 鼠腹腔 巨噬细胞 (PEMq~)呼吸爆发的影响及其与细胞内外游离钙的关系。方法：(1)用亲和层析和离子交换层析等方法从小鼠H 肝癌细胞中获得纯化的HSPgp96。(2)用细胞内过氧化物荧光探针 HDCF—DA监测 HSPgp96作用于小鼠PEMq~ 过程中，单个细胞活性氧(ROS)信号的变化，反映PEMq~内呼吸爆发时的变化过程；用荧光探针 Fluo一3／AM监测 HSPgp96作用于小鼠PEMq~过程中，单个细胞内钙离子([ca ]。)信号的变化。(3)使用细胞膜和细胞内钙通道抑 制剂及钙离子载体后 ，再观察HSPgp96作用后 ROS信号的变化。结果：(1)加入 HSPgp96后 PEMq~内Fluo一3荧 光强度立即上升，70s时增幅达 161．o5％±50．99％；当分别阻断细胞外钙内流、抑制细胞内钙库释放功能后 110s 增幅分别为84．8l％ ±29．52％和46．2l％±17．24％。同时阻断胞内外钙作用，HSPgp96这一诱发功能明显被抑 制。加入钙离子载体后可见细胞内荧光强度迅速增强，于 110S时达 156．98％ ±45．83％，随后迅速下降。(2)小鼠 PEMq~受 HSPgp96刺激后表征ROS的荧光强度立即上升，620s达基础荧光值的636．78％±82．02％，随后始终维 持在高水平。当分别阻断细胞外钙内流、抑制细胞内钙库释放功能后，再加入HSPgp96后细胞内ROS荧光值上升 幅度较小。同时阻断了胞内外钙作用后，HSPgp96刺激后ROS荧光值上升没有明显高峰出现。结论：HSPgp96作 用于小鼠PEMq~后，促进了细胞外钙内流并使细胞内钙库释钙，这是HSPgp96诱发细胞内活性氧增加的基本机制。 [关键词] 热休克蛋白糖蛋白96；活性氧；钙；巨噬细胞 [KEYWORDS] Heatshockproteingp96；Reactiveoxygenspecies；Calcium；Macmphages [中图分类号] R363 [文献标识码] A HSPgp96是热休克蛋 白(heatshockproteins，HSP)家族 白(BSA)和RPMI一1640培养基为Sigma公司产品。其它试剂 中重要的一员，来 自肿瘤细胞的HSPgp96能够激发特异的抗 均为国产分析纯。I~icaTCS—SP2激光共聚焦扫描显微镜 肿瘤免疫应答。最新研究发现，HSPgp96通过与抗原提呈细 (I~ica公司)，REVC二氧化碳培养箱 (AshevilleN．C．)，Ami- 胞表面的受体结合的方式进行抗原提呈，其效率比吞噬介导 con超滤器及截留分子量为 10000的超滤膜为Amicon公司产 的提呈高 10000倍…，巨噬细胞作为 1种重要的抗原提呈细 品。ICR封闭群小鼠购 自南通医学院动物实验中心。H 腹 胞 ．在HSPgp96分子提呈抗原肽中的作用已有报道 ，但利用 水型肝癌细胞株引自中科院上海药物研究所，由本室传代。 激光共聚焦显微镜观察 HSPgp96对巨噬细胞功能，尤其是其 2 方法 2．1 HSPg096提取 、纯化及鉴定 参照文献 的方法，结合 瞬间变化的影响尚未见报道。本研究拟用激光共聚焦显微 本室条件有所改动。简述如下：(1)将小鼠H 肝癌细胞裂 镜可原位、实时观察活细胞变化的特点 ，观察20min内巨噬 解、离心、过滤及透析后获得 H