大鼠GLUT1基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建.pdfVIP

维普资讯 · 2284· 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 200622(1)：2284—2 [文章编号] 1000—4718(2006)11—2284一O3 大鼠GLUT1基因的扩增及其重组 腺病毒载体的构建木 李方成 ， 李军亮 ， 梁伟强 ， 刘然义 ， 吴中华 ， 张培峰’， 袁开长 (中山大学附属第二医院 ’神经外科 ， 整形外科 ，广东 广州 510120； 中山大学肿瘤防治中心实验室，广东 广州 510060) [摘 要] 目的：构建携带大鼠葡萄糖转运体 1基因(GLUT1)的复制缺 ，}!重组腺病毒载体，为进一步研究 脑缺血缺氧引起的神经元死亡机制奠定基础。方法：采用逆转录一聚合酶链反应 (RT—PeR)的方法获取大鼠 GLUT1基因全长cDNA，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle—Glutl，经酶切后与线性化的腺病 毒骨架质粒pAdeno—x体外连接并转化大肠杆菌DH5ct，构建重组腺病毒质粒pAd—Glutl，酶切线性化重组腺病毒 质粒后转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒 ，重组腺病毒在HEK293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反 应 (PCR)及免疫印迹法 (Westernblotting)从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果：经PCR分析及DNA测 序显示GLUT1cDNA序列正确；筛选出重组腺病毒质粒pAd—Glutl后在 HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包 装后冻融细胞行PCR及Westernblotting检测表明重组腺病毒包装成功。结论：成功扩增 了大鼠GLUT1基因并构 建了携带大鼠GLUT1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，这有助于研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡的机制。 [关键词] 葡萄糖转运体 1；基因扩增 ；重组腺病毒载体 [KEYWORDS] Glucosetranspo~er一1；C,eneamplification；Recombinantadenovirnsvector [中图分类号] R363 [文献标识码] A 葡萄糖易化扩散通过细胞膜是细胞进行糖代谢和产生 保真DNAPolymerase购 自Stratagene公司；RevertAid 第一 能量的重要前提，这一过程是在葡萄糖转运体 (glucosetrans． 链 cDNA合成试剂盒及T4DNA连接酶购 自Fermentas公司； porter，GLUT)介导下完成的…。血液中的葡萄糖须首先经血 质粒小量抽提试剂盒及DNA凝胶 回收试剂盒购 自Omega公 脑屏障血管内皮细胞上的GLUT1，然后经神经元细胞膜上的 司；兔抗大鼠GLUT1多克隆抗体购 自Chemicon公司；即用型 GLUT3才能进入细胞进行有氧代谢 ，产生能量 。因此 SABC免疫组化试剂盒购 自武汉博士德生物工程有限公司。 GLUT1是葡萄糖跨膜转运限速过程中的第一步，与神经细胞 3 引物设计合成 赖以生存的能量代谢密切相关。为探讨外源性 GLUT1表达 根据 GenBank中公布的大鼠GLUT1全长cDNA序列 (编 上调对缺血缺氧脑细胞的保护作用，本实验采用体外连接法 号：NM一138827)设计引物 (由上海生物工程有限公司合成)。 构建了大鼠GLUT1重组腺病毒载体。 引物5’端引入 XbaI酶切位点，划线部分；PCR产物大小 16OObp。克 隆 cDNA 引 物：上游引物：5’一AGG．TCTA． 材 料 和 方 法 GAACG