酵母双杂交技术鉴定FAT10新的结合蛋白：eEF1A1.pdfVIP

· 87O · ChineseJournalofPathophysiology 2012，28(5)：870—877 [文章编号] 1000-4718l2012)05-0870一O8 酵母双杂交技术鉴定 FATIO新的结合蛋 白：eEF1AI术 余 新， 刘天德，袁荣发， 王庆诺， 李国惠， 邵江华△ (南昌大学第二附属医院肝胆外科，江西 南昌330006) [摘 要】 目的：利用酵母双杂交技术筛选类泛素蛋白FAT10(HLA—Fadjacenttranscript10)在肝癌细胞 Hep3B中相互作用的蛋白，为探讨FAT10蛋白在肝癌发生中的作用机制提供依据。方法：利用 ClonteehGAIA酵 母双杂交系统筛选人肝癌细胞系Hep3B的eDNA文库，以获得与FAT10相互作用的蛋白分子；通过回交实验、免疫 共沉淀和激光共聚焦细胞 内共定位实验验证两者之间的相互作用；通过 RNA干扰降低 FATIO表达观察真核翻译 延伸因子 lal(eEFIA1)的表达情况。结果：酵母双杂交筛选得到相互作用蛋白eEF1A1，激光共聚焦细胞 内共定 位确定 FAT10和eEF1AI均位于细胞质内，存在共定位；回交实验和免疫共沉淀实验再次确认 eEF1A1能够与 FAT10相互作用 ；FAT10表达降低伴随着 eEF1A1的表达下调。结论 ：FAT10能够与eEF1A1相互作用；FAT10可 能通过eEF1A1来实现其部分功能。 [关键词】 FAT10蛋白质；真核翻译延伸因子 ll；RNA干扰 [中图分类号] R735．7 [文献标志码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2012．05．018 Identification ofanovelFAT10一bindingprotein，eEF1A1，by ayeast two—．hybridsystem YUXin，UUTian—de，YUANRong—fa，WANGQing一／1110，LIGuo—hui，SHAOJiang — — hua (DepartmentofHepatobiliarySurgery，TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity，Nanchang330006，China．E — mail：shao5022@163．corn)，， [ABSTRACT] AIM：ToinvestigatetheroleofHLA—Fadjacenttrnascript10 (FATIO)intumorigenesis． METHODS：GAIA yeasttwo—hybridassaywasperformedtOscreenthehumanHep3B hepatomacelleDNA libraryfor obtainingthehostcellproteinmoleculeswhichinteractwithFAT10．TheimmunofluoresenceCO—localizationandCO—im- munoprecipitationassaywereappliedtoconfirm theinteractionofhteidentifiedproteins．FAT10Was knockdownbysiRNA toinvestigatethechangesofeukaryoticrtanslationelongationfactorIalpha1(eEFIA1)expression．RESULTS：The eEFIA1wasselectedfrom thehostceilsusingyeasttwo—hybridassay．Th eresultsofCO—localizationandCO—immuno— precipitationassaysfurtherconfimr edtheinteractionbetweenFATIOandeEF1A1．Interestingly，whenFATIOwasdown— regulatedbysiRNA inHep3B cells．hteprote