抗转化生长因子β1的U1+snRNA嵌合型核酶体外剪切作用.pdfVIP

维普资讯 理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2007~23(8)：1609-1612 [文章编号] 1000-4718(2007)08—1609—04 抗转化生长因子 的U1snRNA 嵌合型核酶体外剪切作用 刘 芳， 邹 萍， 吴耀辉 ， 张 敏 (华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所 ，湖北 武汉430022) 【摘 要】 目的：研究抗转化生长因子 B。U1snRNA嵌合型锤头状核酶的细胞外切割活性。方法 ：通过计算 机设计针对TGF31．的锤头状核酶，然后把合成的核酶片段克隆人含有 U1snRNA启动子／增强子和终止子的u1 snRNA核酶载体中。通过 RT—PCR扩增获得TGF31。的部分基因片段 ，将其克隆人T载体中，I7启动子的下游 ，体 外转录获得核酶和靶RNA，转录过程中掺人同位素 ，通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化回收。[P]标记的核酶 与靶 RNA在不同条件下进行切割反应，变性PAGE电泳，放射 自显影，分析反应结果。结果：活性的U1snRNA嵌 合型核酶 (U1RzS03)在生理温度下具有 良好特异的切割活性；而点突变型核酶U1Rz803 没有切割活性 ，因此这些 结果显示U1RzS03设计是正确的。结论：本研究中制备的U1Rz803具有 良好的特异催化切割活性。U1snRNA嵌 合型核酶U1Rz803有望在胞内抑制TGF31。的表达，为研究转化生长因子 (TGF)B。在造血调控 中的作用机制提供 有效工具。 [关键词] 转化生长因子B；RNA，催化 ；U1小核 RNA嵌合酶 【中图分类号] R363 【文献标识码] A Cleavageactivityofanti-transforminggrowthfactor RNA byU1snRNA chim ericribozym e in vitro UU Fang，ZOU Ping，WU Yno—hui，ZHANG Min (InstituteofHematology，UnionHospital，torsiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnoloyg，Wuhan 430022。China．E—ma il：fangliuwh@163．corn) [ABSTRACT] AIM：Todeterminethecleavageactivityofanti—transfomringgrowthfactorBlhammerheadri- bozymeswhichwasinseaedintoU1smallnuclearRNA incell—freesystem．METHODS：Thehammerheadribozymetra- getingagainsttrnasfomringgrowthfactorBlwasdesignedthroughthenaalysisofcomputersoftwrae．Theribozymefragments weresynthesizedandclonedintotheU1snRNAribozymevectorpZeoU1EcoSpe，whichcontainedU1snRNA promoter／en- hancerandtemrinator．TGFBicDNApartialfragmentwasgeneratedbyRT—PCR，nadthenclonedintotheT—vectorat thedownstream of，I7promoter．ThetranscriptsofribozymeandtragetRNA incorporatedintoisotopeweretranscribedin vitronadpurifiedbydenaturingpolyacrylamidegelelec