柔红霉素生物合成基因簇的克隆以及其基因打靶的研究.pdfVIP

  柔红霉素生物合成基因簇的克隆以及基因打靶研究 袁天杰 胡又佳 （中国医药工业研究总院，上海医药工业研究院，上海，200437 ） 摘要：本研究通过构建柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌DM 的基因组文库，获得2230 个重组克 隆。利用菌落原位杂交和PCR 两种筛选方法获得黏粒 Cosmid 8-22，其插入片段的大小为41431bp ， 含 36 个完整的开放阅读框，基本包含了完整的柔红霉素生物合成基因簇。利用黏粒 cosmid 8-22， 构建 PCR-Targeting 系统，同时敲除 dauW ，dnrX 基因。HPLC 分析敲除突变株的柔红霉素产量较出 发菌提高了 3-4 倍。 关键词：柔红霉素生物合成基因簇；基因组文库；PCR-targeting ；基因敲除 Abstract ：Genome of Streptomyces coeruleorubidus DM, the producing strain of Daunorubicin(DNR), was used to construct the gene library, A total of 2230 recombinants were obtained. The recombinant cosmid 8-22 was obtained by colony in situ hybridization and PCR amplification, the length of insert fragment of Cosmid 8-22 was 41431bp and harbored 36 intact ORFs which almostly contained the complete DNR biosynthetic gene cluster. The cosmid 8-22 was used to establish the PCR-Targeting system, which can disrupt the gene dauW,dnrX at the same time. The HPLC result was showed that the DNR production of mutant strain was increased significantly, which was nearly about 3- 4 folds higher than the parental strain. Keyword: Daunorubicin biosynthetic cluster; Genomic library; PCR-Targeting; Gene disruption 前 言 随着全球恶性肿瘤的发病率越来越高，抗肿瘤药物成为近年来药物研发的主要领域。而自从 1950 年第一个蒽环类抗生素紫红霉素发现以来，蒽环类抗生素以其良好的生物活性，在治疗人类癌症方 面发挥了重要作用[1] 。柔红霉素是一类临床上广泛使用的蒽环类抗生素，其不仅可以直接作为一线 抗肿瘤药物使用，同时也是其他药物如多柔比星、表柔比星、吡柔比星等抗癌药物的重要原料。 现在，柔红霉素的生物合成途径基本研究清楚，其全部的生物合成基因都处于染色体上并且成 簇排列[2] 。本实验室也对柔红霉素产生菌的基因改造工作有着深入的研究，曾分别对柔红霉素生物 合成途径中的 doxA, dnrV, dnrX ，dauW 等基因进行功能研究[3] 。发现增加doxA ，dnrV 基因拷贝数可 以提高柔红霉素的发酵产量，使其比出发菌提高 105%；而通过同源双交换完全阻断 dnrX 则使突变 株的柔红霉素的产量提高 1.3 倍；对我们实验室发现的负调控基因 dauW 完全敲除，其突变株的柔红 霉素产量则显著提高，最高可以达到出发菌的 7.4 倍[4] 。 但这些研究工作都是基于传统的限制性酶切与连接等步骤，通过构建载体来对单个基因进行研 究。由于柔红霉素生物合成基因成簇排列的特点，当需要对几个基因一起研究时，传统的方法就会 面临着载体构建的复杂性和不稳定性等问题。因此本研究通过建立柔红霉素的基因组文库，筛选柔