鸟氨酸脱羧酶基因沉默抑制宫颈癌细胞生长地的研究.pdfVIP

迟伟玲，等 鸟氨酸脱羧酶基因沉默抑制宫颈癌细胞生长的研究 J。 min，50℃30min，95℃10min， 表达或异常是肿瘤发生过程中最重要的因素之一[2 逆转录，即25℃2 15s和60℃1 抑制ODC的表达可以显著降低组织多胺的水平，抑 然后95。C 制肿瘤细胞的生长。DL—a一二氟甲基鸟氨酸(diflu—扩增。ODC基因的定量通过样本和对照细胞的阈值 oromethylomithine，DFM0)是ODC的特异性抑制循环数(Ct值)进行计算比较。每个反应的Ct值由 剂，在皮肤癌等肿瘤的化学预防中显示了一定效果。 Taq—ManSDS分析软件给出，每个样本Ct值取平均 但DFM0具有耳毒性等毒副反应，临床用量达不到有数，即△Ct一(ODCCt平均数)一(|3一actinCt平均 效的血药浓度，限制了它的广泛应用。在子宫颈癌 ODC表达和多胺生物合成同样处在高水平，已经证明 达量就是2“∽‘值凹]。 1．4 Westernblot分析 多胺类似物DENSPM在宫颈癌有明显的抗肿瘤作 inter— 细胞总蛋白的提取液含有o．15m。l／LNaCl，50 用。本研究应用慢病毒介导RNA干扰(RNA mmol／L 7．4)，2 ference，RNAi)技术特异性地抑制关键基因oDC的Tris—Cl(pH 8．o)，2mmol／L 表达，观察其对Hela细胞增殖的影响，探讨ODC基 EGTA(pH 因作为宫颈癌治疗靶基因的可行性。 100，5mm01／LDTT，O．2mm01／LPMSF和1 1材料与方法 1．1 细胞培养 人类宫颈癌细胞Hela(ATCC，CCL2)和人胚肾 20 细胞293T(HEK293T)在37。C、5％CO。培养箱中(TBS-T)进行非特异性封闭12h。将膜放人含有1 Cruz 培养，培养液DMEM(GIBCO)含有10％胎牛血清，肚g／mL羊抗人ODC多抗(Santa 2 h，用TBST mm01／LL一谷氨酸，100U／mL青霉素，100肛g／mLgy，Inc．)的1％BSATBS—T液中反应2 链霉素。 洗涤3次，每次10min，辣根过氧化物酶标记的兔抗 1．2 ODC基因稳定沉默HeLa细胞系的建立 羊IgG二抗(1：1000)反应1h。1×PBS—T充分洗 利用已构建的ODC基因RNAi慢病毒载体和对涤，免疫复合物用ECL—plus(Amersham min 照病毒载体分别转导HeLa细胞，经克隆筛选建立Buckinghamshire，UK)反应5Kodak胶片曝光。 Innotech ODC基因稳定沉默HeLa细胞系[3“]。将1×105细X光片用Multiimage(Alpha 胞接种于6孔板中，第2天用2MOI(病毒感染复数)图像分析仪进行扫描和分析。对照采用J3一actin特异 vision，USA)。 的浓缩病毒转导细胞，转导液为终体积1mL的含8性抗体(Bio