紫杉醇抑制Hut78细胞生长和诱导凋亡的研究.pdfVIP

紫杉醇抑制Hut78 细胞生长及诱导凋亡的研究1 徐秀莲，孙建方 中国医学科学院中国协和医科大学皮肤病医院，南京（210042 ） E-mail ：sunjf@ 摘 要： 目的研究紫杉醇对皮肤T 细胞淋巴瘤（cutaneous T cell lymphoma, CTCL ）细胞 株Hut78 的生长抑制及凋亡诱导作用，并探讨其诱导凋亡作用的机制。方法 紫杉醇不同浓 度、不同作用时间分别处理 Hut78 细胞，应用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法 （TRAP-PCR-ELISA ）检测端粒酶活性的变化；采用形态学观察和流式细胞仪技术（FCM ） 检测其诱导 Hut78 细胞凋亡的情况；四甲基偶氮唑蓝法（MTT ）测定Hut78 细胞的生长抑 制率。结果 紫杉醇明显下调端粒酶活性表达，对Hut78 细胞具有生长抑制及诱导凋亡作用， 且呈时间依赖和剂量依赖性。表现为G2/M 期阻滞、出现典型的凋亡细胞特征，流式细胞仪 检测，可见明显的凋亡峰。结论 紫杉醇能下调端粒酶的活性，诱导细胞凋亡是其发挥抗癌 作用的机制之一。 关键词： 紫杉醇，CTCL ，细胞凋亡 中图分类号：R75 1. 引言 紫杉醇（paclitaxel ）是从红豆杉属植物紫杉的树皮和树干中提取并开发利用的一种天然 抗癌新药，它的作用方式独特，可使微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡， 诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚，使微管稳定，从而阻止癌细胞的生长[1] 。 近年来的临床应用结果表明，紫杉醇对多种恶性肿瘤均有显著疗效，且对多药耐药性及晚期 [2] 淋巴瘤有明显抑制作用 。本实验采用皮肤T 细胞淋巴瘤细胞株(cutaneous T cell lymphoma, CTCL) Hut78 为材料，研究紫杉醇对CTCL 细胞周期的影响和对细胞凋亡的诱导作用，探讨 紫杉醇诱导CTCL 细胞凋亡的机制，为紫杉醇在CTCL 治疗中应用提供理论依据。 2. 材料和方法 2.1 主要试剂与材料 2.1.1 细胞培养与实验分组 Hut78 细胞为 CTCL 细胞株，购自上海细胞生物研究所。在含 10 ％新生牛血清的 RPMI-1640 培养基，37℃，5 ％ CO2 饱和湿度条件下培养，每3-4 天换液传代，实验选用对 数生长期细胞。实验按紫杉醇浓度分别为0，5，10，50，100，200 ，500，1000nmol/L 分为 8 组。 2.1.2 试剂与材料 端粒酶PCR-ELISA 试剂盒购自瑞士Roche 公司；紫杉醇、MTT 、二甲基亚砜（DMSO ）、 碘化丙锭、RNase A 购自Sigma 公司；RPMI-1640 培养基购自美国Gibco 公司；紫杉醇用无 水乙醇配成586mmol/L 贮存液，-20℃保存备用。 2.2 方法 2.2.1 MTT 法检测细胞生长抑制率 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20030023055 ）的资助。 -1- 取对数生长期肿瘤细胞接种于96 孔板，每孔200µl ，24h 后加入不同浓度（5，10，50， 100，200 ，500，1000nmol/L）的紫杉醇，每种浓度设3 个复孔分别于 12，24 ，48 ，72h 后 进行MTT 试验检测。步骤如下：向每孔内加入20µl MTT(5mg/ml)溶液，37℃、5 ％C02 培 养箱内培养细胞 4h ，1000r/min 离心 5min，弃去孔内培养液，每孔加入 150µl 二甲基亚砜 （DMSO ），振荡10min,使结晶物充分溶解，在酶标仪上测490nm 波长处各孔的吸光度值。 细胞生长抑制率＝（1—实验组A 值/空白对照组A 值）×100％。 2.2.2 端粒酶活性的检测 端粒酶活性检测根据Roche 公司端粒酶PCR-ELISA 试剂盒使用方法操作。（1）制备细 胞裂解液：收集3×105 个细胞，用预冷的PBS 洗 1 次，加入200µl 细胞裂解