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RNA干扰技术在蜱研究中的应用与举例 报告人：周金林 (中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241) 摘要； 蜱是仅次于蚊子的第二大疾病传播媒介，分布广泛，对人和动物的健康危害严重。RNA干 扰技术已经成功应用于线虫、果蝇、真菌及哺乳动物等方面的研究。本文就蜱体内RNA干扰的机理， RNA干扰方法以及在鉴定蜱基因功能、疫苗抗原筛选以及蜱与蜱传病原体的相互作用研究上的应用 进行综述分析，探讨存在的问题和进一步应用前景。同时，结合本实验室应用干扰技术研究蜱的抗 凝血分子，免疫抑制蛋白分子，酶分子等研究成果，举例说明，以期给大家提供一个RNA干扰的理 论与实际综合的介绍。 关键词：蜱；RNAi 蜱是一种常见的动物体表寄生虫，在生物分类学上属于节肢动物门、蛛形纲、蜱螨目、后气门 亚目、蜱总科。它们在世界各地广泛分布，侵袭哺乳类，鸟类、爬行类以及两栖类等动物，被认为 是仅次于蚊子的第二大疾病传播媒介，严重危害着人和动物的健康。 在过去的十年，蜱的功能基因组学的研究取得了快速的发展，其中RNA干扰技术的应用是一个 亮点，并显示出多方面的应用前景。RNA干扰(RNA (double—stranded 丽新小杆线虫(C．elegans)反义RNA(antisenseRNA)的过程中发现的。此后dsRNA介导的 RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中， 并逐渐证实植物中的转录后基因沉默(posttranscriptionalgene 的表现形式【2】。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被 广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。2003年，Aljamali等发表了 第一篇应用RNAi技术研究蜱的功能基因的论文。之后，RNAi技术在鉴定蜱基因功能、疫苗抗原筛 选以及蜱与蜱传病原体的相互作用研究上的都不断有报道。 1．蜱体内的RNAi机制 参与RNAi的酶类主要有双链RNA特异性核酸内切酶(dsRNA．specific 诱导的沉默复合物(RNA．inducedsilencing dependent RNA 具有信号扩增的作用。RNA干扰的机制在黑腹果蝇、杆状秀丽线虫上已经研究的相对透彻，而蜱体 内的RNA干扰机制却知之甚少。相关研究研究表明，黑腹果蝇体内的RNA干扰机制和蜱的最为接 近。Sebastian 188 们选取了10条与黑腹果蝇相关基因相似性在80％以上的序列进行了深入研究，提出了一个在蜱体内 的RNAi的机制。 1．1siRNA的生成 mRNA序列具有同源性。 1．2mRNA的降解 在解旋酶的作用下，siRNA被解链形成正义链和反义链，其中反义链招募其他蛋白和解旋酶形成 的11或12个核苷酸处对mRNA进行切割，从而降解mRNA。 1．3RNAi的放大 就可以产生高效的基因沉默效果。这种依赖于RdRP酶的信号扩增作用，在线虫中广泛存在，而在 黑腹果蝇和蚊子体内尚且没有发现这种效应。 2．蜱体RNA干扰的方法 到蜱体内或蜱细胞内的方法有5种。 2．1注射 。 用汉密尔顿吸管或者显微注射仪将体外合成的dsRNA注射到蜱体内。Aljamali等人是报道的最 早在蜱上应用RNAi的人，他们将dsRNA注射到蜱的血淋巴中引起干扰效应。紧接着delaFuente 等人用汉密尔顿吸管在成蜱腹侧右下第四基节处将dsRNA注射入蜱体内【7】。这种方法简便可靠，重 现性好，并且可以在不同种类的蜱上应用。Narasimhan等人最先用显微注射仪进行注射。相比而言， 显微注射仪可以有效的控制注射的剂量，但是通过这两种方法注射dsRNA的蜱成活率相近。最近 Nijhof等人将dsRNA通过气孔注射到饱血幼蜱体内，成功的进行了干扰，但是这种方法对饱血若蜱 是否有干扰效果，有待于进一步的实验来确证。 2．2浸泡 用dsRNA浸泡蜱、蜱组织或体外培养的蜱细胞。在研究美洲钝眼蜱唾液腺生理功能的实验中， 科学家应用了这种方法。将唾液腺浸泡在含有dsRNA的细胞培养基中，37℃温育6h。这种方法亦 能应用在对幼蜱和若蜱上。 2．3饲喂法 Soares等人最先报道了这种方法。他们将dsRNA放入一毛细微管中，将其置于若蜱的口下板2-