基因功能分析的基本策略.pptVIP

通过DNA同源重组 定向将外源基因插入宿主细胞染色体DNA中 从而使特定目的基因在细胞内或生物体内失活 Embryonic Stem Cells 同源重组 target targeting vector homologous recombination “knockout” TK 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 5′ 5′ 5′ 3′ 3′ 3′ 3′ 待剔除基因 克隆 克隆载体 重组载体 切割基因使待剔除基因失去活性 阳性标记基因Neor 连接 HSV-tk 打靶载体 打靶载体 内切酶消化 线性化打靶载体 转染 基因组 同源重组 同源重组的胚胎干细胞 胚泡 植入 假孕小鼠 杂合子小鼠 正常小鼠 杂合子小鼠 交配 杂合子小鼠 兄妹交配 纯合子小鼠（基因剔除） RNA诱导沉默复合物 RISC对靶mRNA的切割是以内切的方式进行的，而且切割仅发生在与siRNA同源的部分。 RNAi的要素：RISC RISC: RNA-Induced Silencing Complex Exonuclease Homology search activity Endonuclease Helicase 5’ 3’ Target mRNA OH3’ 5’P 形成RISC复合物，降解目的mRNA dsRNA Dicer cleavage of dsRNA siRNA RNAi 抑制基因表达的机理 siRNA associated With RISC complex Cell Membrane 5’P OH3’ Target mRNA RNAi机制 Dicer RISC 碱基互补 酶解 RNA干扰实验的基本过程 1. 确定干扰靶点 干涉靶点序列应具备的条件： ① 尽量避开蛋白结合位点； ② 一般应具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征； ③ G＋C比比例为50%左右； ④ 被干涉的靶序列应该是特异性的，和其它RNA没有同源性； ⑤ 通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列 提供RNAi 在线技术支持的公司（网站） 2.将候选的靶点序列和相应的基因组数据库等进行BLAST比较 3.制备siRNA siRNA制备常用的五种方法： 化学合成 体外转录 长片断dsRNAs经RNase III 类降解 siRNA表达载体在细胞中表达形成shRNAs PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 化学合成 质量高，高纯度，高成本 适用于已经验证过抑制效率的靶点序列 不适于筛选靶点序列 体外转录 成本适中，省时，适用于筛选靶点序列 不适用于长期的研究或者针对某个特定靶点序列的大量研究 长片断dsRNA酶解法 dsRNA在体外被RnaseⅢ家族成员切割成siRNA 不需要验证筛选多个靶点序列 不适用于长期研究或者特定siRNA序列的研究 siRNA表达质粒或者病毒载体在细胞中表达siRNAs AAACCAGCAGAACGTGTACGA 载体介导的细胞内表达siRNA 方法的特点 操作简便，稳定性好 siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于研究 适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷的细胞株 4.对目标RNA的干扰 转染靶细胞 对目标RNA干涉程度进行分析：可采用RT-PCR在RNA水平上监测、Western blot在蛋白质水平上进行监测 RNAi实例(载体法)： Target gene：c-myc 查找靶基因mRNA 利用网络在线支持，寻找siRNA序列 根据查找的siRNA序列，合成长链oligo 构建载体 转染 检测效应（包括干扰效应和生物学效应） 2、/  3、其它网站 1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对） 目的基因mRNA获取： 载体构建： dsDNA形成：退火  载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定转染：瓶颈之一 含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾 (a) (b) 24 h 48 h 干扰组 阴性对照组 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 mRNA相对表达量 c-actin Pokemon 500 300 500 300 (d) Pokemon β-actin (a) Pokemon蛋白相对表达量 干扰组 阴性对照组 48 h 72