蚋类ISSR-PCR反应体系建立与条件优化.pdfVIP

· 124· 蚋类ISSR—PCR反应体系的建立及条件优化 廉国胜1，张春林2，陈汉彬2，柯明剑1 1．珠海出入境检验检疫局，广东珠海，519020；2．贵阳医学院 摘要：目的探索建屯稳定、特异性蚋类ISSR—PCR反应体系，研究蚋类遗传多样性。方法以蚋类摹因组DNA为模版，采用正交 试验设计方法．设计了探索性正交试验和细调性正交试验，对各反应因子进行优化。结果最佳反应体系，即15lll的反应体系中含 有Ixbuffer，dNTP0．25mmol／L，TaqM0．75U。引物0．67 出蚋种特异性条带的ISSR反应体系。最佳体系的建立为今后利用1SSR标记技术，研究蚋类的遗传多样性的标准化程序提供了帮 助。 关键词：蚋类；ISSR；反应体系；正交优化 表1正交试验水平——因素 5因素4水平 蚋类 blackflies ，隶属于昆虫纲双翅目蚋科 Simuliidae ，是 医学昆虫中一个世界性分布的重要类群，它不但骚扰吸血，侵袭 人畜，并且是多种人类和禽畜疾病的传播媒介。从分子水平系 统研究蚋类的遗传多样性，对其监测和防制有重要意义。 sequence ISSR Inter-simplerepeat ．即简单重复序列区 间，是由Zietkiewicz等在1994年创建的。ISSR操作简便、成 本较低、重复性高。多态性好，其引物设计简单，不需要知道简 单莺复序列两端的碱基序列。已在多种动植物的种质鉴定、 遗传作图、基因定位、遗传多样性等研究方面得到应用。 虽然ISSR有诸多优点，但ISSR分子标记技术基于PCR反 应开展的，易受到多种反应条件的影响，不同物种对反应的要 处醐合。器‰。M。e川。。d。N㈣TP。晨‰篙 求也存在差异，因此在应用ISSR分子标记技术时应首先对其 反应条件进行优化。本研究采用正交试验对蚋类ISSR—PCR 反应体系进行优化，为后续蚋类系统发育、分子鉴定和种群遗 传等研究打下良好的基础。 1材料与方法 1．1材料本研究用于DNA提取的蚋种标本均采自野外，保 存在无水乙醇中，并于一20。C贮存备用。 1．2方法 1．2．1基因组DNA提取、定量单蚋基因组DNA的提取方法 按常规采用酚一氯仿法。全部标本均用核酸定量仪测定A260 和A280，计算DNA浓度和纯度。将DNA标本稀释到50ng／ 仙l，一20℃保存。 1．2．2 PCR扩增反应体系为15斗l体系，扩增条件为：94。C 预变性5min。94℃变性1min，退火45min，720C延伸1min30 s，进行40个循环，72。C延伸7min，10℃保存。扩增产物在 1．5％琼脂糖凝胶中作电泳分析。 1．2．3正交设计试验优化ISSR反应体系 1．2．3．1探索性粗调筛选采用L16 45 对Taq酶、Me+浓度、 dNTP、引物及模板浓度进行5因素4水平的探索性筛选分 析。设计方案见表l和表2。 1．2．3．2细调性筛选采用L9 3‘ 对Taq酶、dNTP、引物及 水平。黧：…二，。器。二， Me+浓度进行4因素3水平的细调性筛选分析 表3，表4 。 1．2．3．3正交设计的直观分析参照何正文的方法，依扩增 条带的敏感性与特异性，即条带的强弱和杂带的多少将各处 理的结果做i．9分记分。分数越高，表示敏感性、特异性越好。 一*。盎：…． ，。?!‰ 时舢一m”Ⅻ拍加¨¨拍旧 ：：一一 霎蠹囊爱麓缫瓣鍪巍 一一一一