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三、 体外基因表达水平的分析（讨论稿）： 近年来的科学研究越来越多地将疾病与 mRNA 的表达水平联系起来，所以越来越多的实验者在进 行研究时，除了进行免疫组化、Western、Elisa 等蛋白水平的定量和定性实验，往往会进一步深入研 究基因表达与疾病变化的关系。 与 PCR 相关的技术包括：RT-PCR，巢式 PCR，反向 PCR，不对称 PCR，原位 PCR 等。 （一）、单基因半定量 RT-PCR 实验： 在细胞内 mRNA 的表达水平直接与蛋白的表达水平相关，所以实验者往往是检测某基因 mRNA 的表达与某种疾病的相互关系，从而研究并探讨疾病的致病机理。 1、RT-PCR 实验： RT-PCR 是将 RNA 的反转录（RT）和cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 A ）、巢式 PCR：巢式 PCR 既是采用巢式引物进行的 PCR 实验，在实验过程中不管是内参 基因还是目的基因，均设计成巢式引物。巢式引物一般有 4 条引物（上游两条，下游两条），进行 一次 PCR 扩增时，可以有三种组合，如果进行两次扩增，还可以有五种组合，合计共有 9 种组合。 这不仅使实验成功机率会大大提高，还可以加快实验的速度，节约时间。更重要的是提高扩增的特 异性，在一次被扩增的产物中，只有在其序列中有内侧引物结合位点地扩增片段，才能在第二次 PCR 中被扩增，否则不被扩增。这对表达相当低的目的基因 mRNA 的扩增，这几乎是唯一的选择。 B）、定量法： 定量 PCR 技术有广义和狭义概念。广义概念的定量 PCR 技术是指以内参或外参为标准，通过 对 PCR 放大后的 DNA 产物的含量来推导原来标本中特定 DNA 或 mRNA 的含量。 所谓外参法是指样本与阳性参照在两个反应管中进行。内参法是指样本与阳性参照在同一个反 应管内进行。外参法未对样品进行质控监测，也未监测扩增效率，定量不准。内参法能对样品进行 质控监测，样本与阳性参照也能保持相同的扩增效率，但无法保证每管中起始模板数相同，难以进 行对比分析，下面简单说明一下外参法和内参法的优缺点： 1）、选择一种作为内标准的模板将其测定出绝对含量后，作一系列稀释，然后将样品 cDNA 与不同稀释度的内标按一定比例混合，再进行 PCR 扩增。此方法要求目的基因和内标模板能用一 对引物进行扩增，而且两者的扩增产物能区别开来（长度差异或有限制性内切酶酶切位电差异）。 如果样品目的基因扩增片段强度与某一稀释度内标模板扩增片段强度相仿，则据内标模板的含量就 可以确定出目的基因 mRNA 含量和拷贝数。但这种模板需要特殊制备，不易得到。 2 ）、采用细胞中某种稳定表达的基因的 mRNA 作为内标，但其扩增引物与目的基因引物并不 相同。内标和目的基因在同一扩增管内，同时进行扩增。然后计算内标基因和目的基因 cDNA 扩 增片段强度的比值，即所谓的相对定量法。 这两种方法各有特点。前者能确定某扩增管中所含目的基因 cDNA 模板的含量，但缺点是无 法知道这些目的基因来源于多少个细胞中。这对于测定正常组织和病理组织、不同个体间、药物治 疗前后、应激刺激前后、不同生长发育期等某一基因变化的观察带来很大的困难。最大的问题是： 你无法保证各扩增管中的模板 cDNA 均能来源于同样数量的细胞。由于取样量多少的不同，提取 细胞总 RNA 的效率不同，RT 反应效率的区别，模板取样量多为 1ul 左右，在此体积上取样的体积 量波动较大，各次各管的 PCR 效率也不尽相同等诸多原因，造成实验的较大误差。而后者虽然不 能定出扩增管中最初的模板的绝对量，但由于目的和内标基因均使用同一模板 cDNA，测定其目 的基因和内标基因的相对比值，而此相对比值不因细胞数量多少而发生改变，因而更适合于上述比 较测定。这种方法不需要特殊制备模板，但对其引物的设计有更高的要求。 C）、RT 反应的要素： 1）、高品质的 RNA：成功的 cDNA 合成来自高质量的 RNA，所以提取高品质的细