利用96孔板与酿酒酵母生长圈复合筛选高产管囊酵母.pdfVIP

第四届全国大学生创新年会 The 2011年lO月 4thChinese Forum UniversityStudents’Creativity 利用96孔板和酿酒酵母生长圈复合筛选高产管囊酵母 蔡万华，丁少鹏，叶蕊芳木，耿丽云，倪琳，苏阳措 (华东理工大学，生物工程学院，上海) 摘要：野生酿酒酵母不能利用木糖作为碳源，但是可以利用乙醇作为碳源和能源。管囊酵母可以利用木糖 生产乙醇。酿酒酵母可以利用管囊酵母生产的乙醇作为碳源。本实验将管囊酵母进行紫外诱变后，96孔板培 养，选取OD较高的孔进行酿酒酵母生长圈筛选。管囊酵母在木糖(5％)为唯一碳源的YNB培养基上生长 并产生乙醇。产生的乙醇越多，指示菌酿酒酵母的生长圈相对越大。利用酿酒酵母生长圈法筛选的正变率为 35．22％，筛出一株uVl7l乙醇产量为10．79／L，比对照高25．9％。 关键词：管囊酵母；96孔板培养；酿酒酵母生长圈；木糖乙醇发酵 由于化石燃料的不可再生性，短缺性以及污染性，作为生物燃料的乙醇的研究逐步显得 重要。在纤维素水解液中，木糖约占了单糖的30％。两份独立的调查报告估算出如果将水解 液里面的木糖充分利用，那么木质纤维素乙醇生产的成本将会降低约20％[11。那么得到高效利 用木糖产乙醇的菌株变得尤为重要。目前发酵木糖产乙醇的微生物主要有基因工程菌和天然 微生物两种。一般后者代谢木糖产乙醇的效率较前者低‘21。但天然微生物的稳定性有利于提高 工艺的可靠性，所以仍然获得了较为广泛的研究。 本文采用了96孔板，结合酿酒酵母生长圈法对管囊酵母紫外诱变后进行定向筛选。并研 究了酿酒酵母生长圈和管囊酵母菌落两者直径的比值(di／dp)与管囊酵母乙醇生产能力的关 系。 1材料和方法 1．1实验菌种 管囊酵母(Pachysolentannophilus)由华东理工大学华东理工大学生物反应器国家重点实 验室提供。 1．2培养基 种子培养基(朗)：木糖20，蛋白胨20，酵母膏lO。 发酵培养基(鲈)：木糖50，酵母粉l，硫酸镁1，磷酸二氢钾2，硫酸铵1。 96孔板培养基(酊)：木糖醇50，酵母粉l，硫酸镁1，磷酸二氢钾2，硫酸铵l。 13．4，琼脂15。 YNB筛选培养基(g／1)：木糖50，YNB l-3培养方法 斜面培养： 将原始保藏菌株接种到斜面培养基上，30±0．5C，400／o-60％湿度的培养箱中 培养72小时。 种子培养： 从斜面上挑取一定量的菌，加入到装有50ral种子培养基的250mi三角瓶中 100 第四届全国大学生创新年会 4th 2011年10月 The Chm船e Forum UniversityStudents’Creativity 30±0．5℃、180rpm培养24小时。 发酵培养：将培养好的种子液按10％的接种量到装有50ml发酵培养基的250mi三角瓶中， 30±0．5℃、100rpm培养72小时。 96孔板培养：将诱变后的菌悬液按10％的接种量接到装有200ul发酵液的孔中，将96孔 板固定在摇床上，30±O．5C、100rpm培养48小时。 YNB培养基过滤除菌，其他所有灭菌条件都是115。C，15min高压灭菌。 1．4实验方法 1．4．1菌体生长量测定利用比浊法测定发酵液的oD咖 1．4．2木糖利用3，5．二硝基水杨酸法(DNS)131。 1．4．3乙醇含量的测定 0．53mmX 柱AFSE-54(30mX1．Oum)，检测器为氢离子火焰检测器。色谱条件：用氮气作为载气， 积分方法：内标法。内标物为正丙醇。 1．4．4菌种的诱变筛选 将培养72h的管囊酵母斜面接种到种子液，生长至对数期。并对其进行紫外诱变H1。稀释 一定倍数接种到96孔板中。培养48h，选取生物量较高的孔样，将其稀释一定倍数涂布在含 有106个酿酒酵母细胞／ml的