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大鼠急性脊髓损伤后Bak基因的表达及其意义 　　[摘要] 目的 探讨Bak基因在大鼠急性脊髓损伤（ASCI）中的表达及其意义。 方法 选取64只SD大鼠随机分为模型及对照两组，每组32只，模型组以改良Allens法制作SD大鼠急性脊髓损伤动物模型，对照组只行椎板切开不损伤脊髓。分别于伤后3 h、1、3、7 d时（每个时间点8只）应用改良Tarlov评分法评价其神经功能；然后处死动物，取受损节段脊髓行HE染色及免疫组化染色，观察形态学改变和Bak基因表达的特点；并应用TUNEL方法检测神经细胞凋亡情况。其量的评定借助于麦克奥迪数码医学图像分析系统A（Motic.med 6.0）软件，结果分别用累积光密度及细胞凋亡指数来表示。 结果 对照组大鼠下肢功能均无明显瘫痪，模型组大鼠下肢均出现不同程度功能障碍，对照组各时间点的Tarlov评分均高于实验组（P0.05）。对照组各时间点脊髓组织未见明显出血、水肿和细胞凋亡坏死，模型组各时间点脊髓组织均有不同程度出血、水肿、细胞凋亡及坏死。对照组未见明显Bak基因表达，模型组各时间点Bak基因表达均明显高于对照组（P0.05），模型组内Bak基因表达3 h点出现，1 d增加，3 d达高峰，7 d明显减少。模型组内细胞凋亡3 h点少量出现，1 d增加，3 d达高峰，7 d明显减少。 结论 脊髓损伤激活Bak基因表达，从而诱导神经细胞凋亡，可能为其病情进展的重要机制之一。 　　[关键词] 脊髓损伤；Bak基因；细胞凋亡；Bcl-2家族 　　[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）12-26-04 　　脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）包括原发性和继发性两种形态，以后者最为多见，多由急性外伤引发。随着现代机械产业和交通运输的发展，其发病率在世界范围内逐年升高，为目前全球性医学研究热点之一[1-2]。研究结果显示，脊髓损伤可累及感觉、运动、反射等多项生理功能；临床表现为组织水肿、缺血、细胞坏死等，其中，神经细胞凋亡为其继 　　发性功能退变的主要机制。Bak基因为Bcl-2同源类似物，可介导Bcl-2的凋亡抑制效应，具有促凋亡样作用。临床癌症研究结果显示[3-4]，Bal-xl/Bak表达异常，可介导癌细胞的增生或凋亡过程，影响患者的病情进展和预后转归。近年研究表明，Bcl-2家族在脊髓损伤的发病过程中，发挥了重用作用，其中Bcl-2低表达为脊髓神经细胞大量凋亡的重用触发因素之一。本研究以急性脊髓损伤大鼠模型的Bak表达情况与神经细胞凋亡的关系为切入点，探讨Bak基因在大鼠急性脊髓损伤（ASCI）中的表达及其意义，报道如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 实验材料 　　1.1.1 动物与分组 健康SPF级SD大鼠64只（由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供），雌雄各半；月龄3～3.5个月，平均（3.2±0.6）个月；体重205～240 g，平均（221.0±17.3）g。随机分为模型组和对照组各32只，适应性饲养3～5 d；饲养环境：温度21～25℃，湿度55%～65%。 　　1.1.2 主要仪器 Allens撞击器（采用不锈钢自行制备）；全自动石蜡切片机（ERM4000，常州市郝思琳医用仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（WD841-1，吴江万达电热设备有限公司）；超低温冰箱（DW-86L205，广州傲雪制冷设备有限公司）；荧光显微镜（CYG-055D，麦克奥迪）等。 　　1.1.3 主要试剂 青霉素注射液（山东鲁抗医药股份有限公司）；庆大霉素注射液（山东鲁抗医药股份有限公司）；HE染色液试剂盒（上海亿欣生物有限公司）；TUNEL试剂盒（南京凯基）；Bax一抗（abcam）；Bax二抗（abcam）；其他试剂如二甲苯、蔗糖、无水乙醇等均为国产分析纯。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 大鼠脊髓损伤模型的制备方法 模型组以改良Allens法制备脊髓损伤大鼠模型，对照组行椎板切开，不损伤脊髓。制备方法：（1）1%戊巴比妥钠（0.1 mL/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于解剖板；（2）以浮肋与13胸椎连接处为基准点，在5 cm2范围内脱毛，显露光滑皮肤组织；（3）酒精消毒，以消毒器械操作，在后正中线2～3 cm做纵行切口，依次切开皮肤、筋膜，可见白色腱膜；（4）借助剥离分针钝性剥离椎旁肌肉丛，可暴露棘突、椎板和横突；（5）定位并标记T10胸椎，在椎体上下中横向切口，再以两个纵向切口将其连接成方形结构，并以咬骨钳去除该骨板，显露方形骨窗；（6）以自制Allens撞击器打击T10胸椎内侧，保持自由落体运动，控制高度约2.5～3.0 cm，每次击打保持在打击点停留2～3 min；（7）至脊髓组织出现血肿，硬脊膜