PRRSV+GP5基因RNA体外转录合成其靶脱氧核酶初步筛选.pdfVIP

504 o2011年学术年会 T030151 PRRSV GP5基因RNA的体外转录合成及其靶脱氧核酶的初步筛选宰 宋德武” 吕字华丁壮”’刘 慧母连志 (吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062) 目的 and virus，PRRSV)可以引发 猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiverespiratorysynome 以妊娠母猪的流产、死产、弱胎、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的 疾病，目前该病在许多养猪国家爆发流行，成为威胁养猪业安全的重要病原之一。为探讨脱氧核酶在抑 GP5基因RNA并用该RNA对其所设计靶脱氧核酶 制PRRSV复制研究，利用体外转录方法制备PRRSV 进行初步筛选。 材料方法 带有盯启动子序列的GP5基因，并将其连接到PuM．T HI双酶切反 simple克隆载体上，经HindlII和Bam T7 模板。体外转录反应用RiboMAXTM ExpressSystem体外转录试剂盒(Promega公司，美国)进行， 经体外转录获得GP5基因的单链RNA片段，将其纯化后作为体外脱氧核酶切割反应的底物。根据GP5基 uL，Tds．cl 因RNA的一、二级结构设计合成4种靶向10--一23脱氧核酶。切割体系：MgCl2(100mM)1 la (250mM，PH=7．55)2uL，转录产物1L(1pm01)，DZl|l u EDTAluL终止反应。初步应用3％琼脂糖凝胶 L。充分混合上述混合物，37C孵育，2h后加入0．5M 电泳进行观察，初步筛选具有体外切割活性的脱氧核酶。 结果 T7 经测序鉴定，正确地构建含T7启动子的GP5基因的重组质粒，按RiboMAXTM ExpressSystem体 la u 外转录试剂盒说明将1 g线性重组质粒转录出80．12g高纯度的GP5基因RNA。经筛选，有2种脱氧 核酶DZ-10、DZ．12对该RNA体外具有切割活性，经分析其体外剪切效率分别为56％和91％。 讨论 T7 通过构建含有T7启动子序列的GP5基因的重组质粒，用RiboMAXTM ExpressSystem体外转录试 剂盒成功制备了高纯度的GP5基因RNA，经体外剪切筛选出具有体外切割活性的2种脱氧核酶，其中 DZ．12具有高效切割活性，为进一步研究脱氧核酶在细胞水平、体内水平剪切GP5基因mRNA，抑制 PRRSVGP5基因的蛋白表达奠定了基础，并有望应用于抗病毒药物开发和转基因动物研究。 参考文献(略) ·基金项目：广东省科技关攻霞大项目(2008A020100020)吉林大学研究生创新基金资助项目。 ··作者简介：宋德武，男，在读硕士研究乍，主要从事分子病毒学及动物传染病防控研究。 “’通讯作者：丁壮，E．mail：1)ing_zhuang@yahoo．c01nCll·