津血源增加口干症模型鼠唾液分泌机制的实验研究.docVIP

津血源增加口干症模型鼠唾液分泌机制的实验研究 　　[摘要] 为分析津血源的具体作用机制，该实验对津血源增加口干症模型SD大鼠唾液分泌与激动受体之间的关系进行了研究。研究通过使用M受体阻滞剂4-二苯乙酰氧基-N-甲基-哌啶（4-DAMP）和阿托品，或肾上腺受体阻滞剂酚妥拉明，制作3组口干症模型大鼠；造模成功后，予中药津血源灌胃，根据临床常用剂量及SD大鼠体表面积换算，阿托品组将实验动物分为津血源低、中、高剂量组，4-DAMP及酚妥拉明组灌胃中剂量津血源。所有动物给药后，连续测定150 min的唾液分泌量，观察津血源增加唾液分泌的作用特点及与受体之间的关系；并分离大鼠的颌下腺组织，通过Western blot分析津血源对颌下腺细胞水分子通道蛋白5（AQP5）表达的影响。结果发现，比较各组唾液分泌量，与生理盐水组、酚妥拉明组、4-DAMP组及阿托品组相比，津血源组的唾液分泌明显增加，并存在明显差异，P3受体）、肾上腺素受体介导的作用途径，增加唾液腺细胞膜AQP5的表达，促进唾液分泌。 　　[关键词] 津血源；干燥综合征（SS）；唾液分泌；肾上腺素受体；毒蕈碱M3受体；AQP5 　　[收稿日期] 2014-01-18 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目；江苏省自然科学基金项目（BK2011870） 　　[通信作者] 钱先，教授，博士，主任医师，研究方向为风湿免疫病的中西医临床研究，Tel： （02591905，E-mail：moneyfirst1@163.com 　　干燥综合征（Sjogren′s syndrome，SS），又称口眼干燥综合症，是一种常见的慢性炎症性的自身免疫疾病，主要累及外分泌腺体，临床上主要表现为口眼干燥、皮肤干燥，常累及肺脏、肾脏等系统损害。本病属中医“燥证”的范畴，症候表现以内燥为主，亦有外燥表现。西医的治疗手段主要局限于免疫抑制剂、糖皮质激素及催涎剂，且易出现毒副作用，而中医中药在治疗SS方面却发挥了良好的疗效。津血源颗粒是基于“津血同源”的中医理论而自制的江苏省中医院院内制剂，具有滋阴养血润燥之效，主要用于SS等自身免疫疾病的干燥症候，临床应用疗效达85%，长期应用无毒副作用，病人依从性良好。 　　以往的临床研究[1-2]表明：津血源可明显改善患者的干燥症状。本课题组前期的动物实验研究[3-6]显示津血源能明显促进SS模型鼠唾液分泌，但其具体机制尚未完全阐明。水分子通道蛋白（AQPs）是一系列含6个跨膜感受器的家族，像管道一样联系细胞的腔面和血管面，起着水分运输的作用。既往研究[7]报道，AQPs与唾液分泌相关。由AQPs转运的水分占唾液中水分总量的60%[8]，但目前只有AQP5证实与SS患者唾液分泌密切相关。 　　本实验在前期研究的基础上，在口干症动物模型上明确津血源激动受体的途径和作用特点，研究津血源对唾液腺细胞AQP5表达量的影响，为后续研究津血源的生津作用涉及的信号传导通路提供实验基础，为“津血同源”的中医传统理论提供系统依据。 　　1 材料 　　1.1 动物 健康雄性SD大鼠（年龄7～8周），体重（200±10） g，由中国医学科学院实验动物研究所提供。 　　1.2 药物、试剂及耗材 津血源浸膏（每1 mL含原药1 g）：江苏省中医院药厂生产，本研究采用成形前的稠膏，并按药典的标准与要求进行检验和定性定量控制，具体药方组成生地黄、南沙参、麦冬、鹿含草、白芍、乌梅、水牛角、土茯苓、丹参、威灵仙、薪蛇；乌拉坦（化学名氨基甲酸乙酯 C3H7NO2）500 g，购买于上海青析化工科技有限公司； 0.9%氯化钠注射液，购于南京小营药业集团有限公司；毛果芸香碱滴眼液，购于永光制药有限公司；硫酸阿托品注射液，购于上海禾丰制药有限公司；4-二苯乙酰氧基-N-甲基-哌啶（4-DAMP）购于sigma公司；酚妥拉明购于扬州制药有限公司。 　　一抗：稀释1 000倍的抗AQP5多克隆抗体，Abcam ab78486。二抗：羊抗兔-HRP；Protein Marker（江苏南京钟鼎生物自制）。Acr，Bis，Tris（购自Sigma公司）；SDS（购自Amresco公司）；TEMED（购自BIO-RAD公司）；其他试剂均为国产分析纯。 　　Allegra 21R台式高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司）；台式高速离心机（德国SORVAL公司）；Gel Doc2000 成像系统、垂直电泳系统（美国BIO-RAD公司）；320-S pH 计（美国Mettler Toledo公司）；AR5120 电子天平（美国AHOΜS公司）；MultiTempⅢ恒温水浴锅；雪花状制冰机（日本SANYO公司）；超净工作台（中国苏净集团）；NANODROP2000（The