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SARS冠状病毒受体结合域的原核表达及蹄鼻蝠ACE2基因的克隆测序 中文摘要 合域(ReceptorBinding S1结构不同，其相应宿主细胞上的受体也不相同，因此它决定了冠状病毒对不同的 宿主细胞嗜性。S2包含一个融合多肽，并有两个疏水区(HRl、HR2)，可形成同种或 异种寡二聚体，携带位于HRIN端的融合多肽和跨膜锚定肽进入结合的宿主细胞，S2 的构象发生变化，最终与细胞膜的融合。同时s蛋白是一个重要的抗原表位，能够诱 导机体产生高亲和力的中和性抗体，可以作为疫苗研究的重要候选靶位，具有疾病 的预防与治疗价值。 关于SARS—CoV的起源研究已经取得了一些研究进展，从人类SARS病人身上分离 动物，原本只是感染动物的冠状病毒由于发生基因突变、重组，产生变异株，导致 抗原性和致病性的改变，从而成为感染人的病原体，由动物传给人并引起人类致病。 已经在野生动物果子狸、鼠和猫等动物中分离至USARS—CoY，这些物种可能只是中间 宿主，近来又在蝙蝠体内也发现了SARS-LCoV，这种病毒的最终来源于哪种动物到目 前为止尚未清楚。血管紧张素转换酶2(angtiotension—covertingenzyme2，ACE2) 是一种金属肽酶，过去已知其主要参与了包括血管紧张素在内的多种肽的代谢过程， 在心血管疾病的病理生理方面发挥着重要作用。现研究证明ACE2也是SARS—CoY的重 者的结构和变异与病毒跨种属传播的机制密切相关。 本研究通过扩增SARS—CoYS蛋白的RBD基因，构建原核表达的重组质粒，在大肠 1 I酶切位点的上下游特异引物，以人和果子狸来源的SARS—CoY的S蛋白基因为 年NXho n Easy载体进行T—A连接，转化DH5 模板扩增RBD基因。产物经回收纯化后与pGEM—T 大肠杆菌，提取质粒后用限制性内切酶消化，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并送测序，结 bank报导SARS—CoV 进行连接，构建其原核表达的重组载体，用限制性内切酶消化确认阳性克隆，并在 (Western Blotting)检测表达情况，重组S蛋白的RBD基因能够在大肠杆菌获得良好 的融合表达，表达的蛋白分子量约为47．6kD。同时我们根据其它物种已知的ACE2序 SARS冠状病毒受体结合域的原核表达及蹄鼻蝠ACE2基因的克隆测序 中文摘要 ofcDNA ends，RACE) 列设计特异引物，应用cDNA末端快速扩增(rapidamplification 放读码框(ORF)，PCR产物与pGEM—T I和XhoI酶切位点的上下游特异 长度为2418bp，酶切位点分析后重新设计含有Kpn 构建了用于真核表达的重组质粒，为构建稳定表达的细胞系做好准备工作。 SARS是一种新的突发性传染病，可通过呼吸道等途径在人群间传播。严重危害 人民群众的身体健康，给社会经济带来巨大影响。因此我们拟通过基因工程技术表 治疗。同时克隆测序了蹄鼻蝠的SARS—CoV受体ACE2，并构建了真核的表达载体系统， 为蝙蝠在SARS感染与传播机制中的地位研究奠定基础。 关键词：SARS冠状病毒；受体结合域；表达；血管紧张素转换酶2；蹄鼻蝠； 测序 sARs冠状病毒受体结合域的原核表达及蹄鼻蝠AcE2基因的克隆测序 英文摘要 Prokaryotic of Domainonthe ExpressionReGeptor