TNFα和TNFR1基因敲除小鼠对内质网应激反应所致急性肾损伤的易感性及其机制研究.pdfVIP

福州总医院学报 2011年 3月第 l8卷第 1期 ·9 · · 实 验 研 究 · TNFa和 TNFR1基因敲除小鼠对 内质网应激 反应所致急性肾损伤的易感性及其机制研究 黄梁浒 张瑞华 吴 谨 陈 建1 谭建明1 郑 丰1，2 1 材料与方法 CA)。凋亡细胞染色首先用20mg／ml的蛋白酶 K消化细胞 1．1 小鼠 2．5分钟，然后与末端脱氧核苷酸转移酶反应 1小时，加入 C57／B6，J、鼠，雌性，3—5月龄，TNFcI一／一、TN— 过氧化物酶标记的抗地高辛和 DAB显色，并用苏木素复染 FRt一／一、TNFR2一／一和 TNFR1R2一／一小鼠，购买 细胞核。显微镜下 (×400倍)计数凋亡细胞，每张切片至 于Jackson实验室 (BarHarbor，ME)。所有基因敲除小鼠与 少计数十个随机视野。对于衣霉素诱导的肾组织损伤切片， C57／B6小鼠回交至少 6代。PCR基 因分型参照Jackson实 若进行肾近曲小管标志物、集合管标志物和细胞凋亡的联 验室提供的方法 (http：／／jaxmice．jax．org／protocols)。以 合染色，首先行碱性磷酸酶 (红色)染色，然后再行凋亡 1 Fa一／一、1 1一／一、，I 2 一／一和 咖 之1R2 染色 (棕色或深棕)；或者先行凋亡染色 (棕色或深棕)然 一 ／一小鼠同窝出生的野生小鼠作为对照。小鼠饲养于SPF 后再行水通道蛋白2染色 (蓝色)。 环境，并可自由饮食、喝水。所有动物操作程序经过美国 1．5 免疫印迹 西奈山医学院动物管理和使用委员会批准。 小鼠处死后，取适量肾皮质，加入含蛋白酶抑制剂的 1．2 衣霉素诱导急性内质网应激 组织蛋白裂解液[，。组织蛋白定量后，按每孔加入等量蛋 TNFa一／一，J、鼠 (n=20)、TNFR1～／一，J、鼠 (n= 白量制备蛋白电泳上样液。电泳后将蛋白转移至 PVDF膜 20)、TNFR2一／一，J、鼠 (n=12)以及 TNFR1R2一／一，J、 上，加入 GRP78抗体 (1：1000，ABR—AfnityBioreagents， 鼠 (n=12)和C57／B6小鼠 (n=16)腹腔注射衣霉素，剂 Golden，co)、磷酸化的 elF2a抗体 (1：1000，Stressgen， 量为 1n kgfo2—4天后处死小鼠，收集尿、血、肾组织和 AnnArbor，MI)和 CHOP抗体 (1：1000。AlexisBiochemi． 肝组织组织。采用4一硝基苯基磷酸氢二钠法，检测小鼠尿 cals，SanDiego，CA)孵育。显影后将抗体洗脱，再次加入 液碱性磷酸酶活性，并以尿肌酐水平校正。采用 比色法 GRP一94抗体 (1：5000；ABR—AfnityBioreagents)或总 (TE∞Diagnostic，Anaheim,CA)检测血尿素氮水平。TNF~t eIF2a抗 体 (1：5000；BethylLaboratories，Montgomery, 一 ／一和 C57／B6小 鼠 (n=4／组)注射顺铂 (cisplatin， TX)孵育。显影后洗脱抗体，孵育上样对照 8一acfin的抗 体。每个蛋白分子至少重复实验两次。 30m4g／kg)，共三天。 1．3 组织学 1．6 RT—PCR 用PBS灌注肾组织，4％多聚甲醛固定[1】。固定48小 从肾皮质提取总 RNA，并按文献报道方法进行反转 时后，PBs清洗组织，用甲基丙烯酸盐或低熔点石蜡包埋， 录 [1|2J。半定量PCR检测XBP～lmRNA表达，引物序列： 制成 4um厚的切片，PAS染