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犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及鉴定 孙 玮 ，王铁成。，u，杨松涛。．u，高玉伟。～，王承宇 一， 张 涛 ，杨玉姣 ，刘玉秀 ，阮 洋 ，靳晓霞 ，夏成柱。 (1．吉林大学畜牧兽 医学 院，吉林长春 l30062；2．解放军军事兽医研究所 ，吉林长春 130062； 3．吉林省人兽共患病预 防与控制重点实验室 ，吉林长春 130062) 摘 要 ：将纯化的犬瘟热病毒 (CDV)分别与弗氏完全佐剂 (CFA)和弗氏不完全佐剂 (IFA)乳化制备 的 乳化抗原作为免疫原 ，以有限稀释法和间接 ELISA法进行单克隆抗体的筛选，从而获得 了3株稳定分泌单 克隆抗体的杂交瘤细胞株 2F7、3G2、5E3。亚型鉴定结果显示，2F7为 IgG2a型，3G2为 IgG1，5E3为 IgGM 。 用 2F7制备的荧光抗体对感染 CDV 3d的 Vero细胞进行 染色观察 ，结果表 明 ，荧光抗体具有很好 的特异 性，染色效价为 1：200，获得的单克隆抗体可用作犬瘟热病毒抗原检al4的诊 断试剂。 关键词 ：犬瘟热病毒 ；杂交瘤 ；单克隆抗体 中图分类号 ：$852．659．5 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2011)03—0073—05 犬瘟 热是 由犬瘟热病毒 (Caninedistempervi— 产品；HRP标记 的羊抗 鼠 IgG为沈 阳联星公司产 rus，CDV)引起的犬和其他 肉食动物 的一种多发性、 品；Sephrose4FF凝胶为 Amersham Biosciences公 致死性传染病。犬瘟热病毒与牛瘟病毒、海豹瘟病 司产品；抗体亚 型鉴定试剂盒为 Sigma公司 (Lot： 毒同属副黏病毒科 ，麻疹病毒属 。犬瘟热病毒为有 114k4817)产品；紫外检测仪为北京 医用机械厂产 囊膜、负链 、单股 RNA病毒L1屯]。RNA 编码 6种结 品，分光光度计为 Thermo公司产品。其余试剂为 构蛋白：融合 蛋 白(F)和血凝 蛋 白(H)，基质蛋 白 分析纯或化学纯。 (M)，磷蛋 白 (P)，大 L蛋 白和核衣 壳蛋 白 (N)[引。 1．1．2 动物和细胞 6周龄 ～8周龄 的纯系雌性 其 中，核衣壳蛋白是麻疹病毒属 中含量最多、保守性 Balb／e小鼠，体重约为 l4g～18g，由长春生物制 品 最强的蛋 白。病毒的囊膜通过穿膜作用将血凝素蛋 所提供 。Sp2／0骨髓瘤细胞 、Vero细胞 由军事兽医 白(H)和融合蛋 白(F)导人到宿主细胞 内，并且对基 研究所病毒室提供。 质蛋 白(M)起着稳定作用 [4]。虽然近 l0年 已经在 1．2 方法 易感动物 中广泛接种犬瘟热疫苗 ，但是该病仍在犬 1．2．1 抗原 的制备 将 CDV 接种于单层生长至 科动物 中流行 。感染犬瘟热病毒的靶 向组织主要是 9O 的Vero细胞 中，当细胞病变 (CPE)达到 8O 黏膜和淋 巴组织 。通过气溶胶感染 ，病毒最先在动 ～ 9O 时 收获病毒 。细胞培 养物 反 复冻 融 3次 ， 物的呼吸道淋 巴组织中复制 ，然后扩散到各种器官 4℃条件下 ，4000r／min离心 30min去 除细胞碎 中，包括呼吸器官、消化器 官、淋 巴样器官和膀胱。 片，取上清 。病毒液用 PEG6000初步沉淀后 ，通过 这样就可以导致隐性感染或者同时引起继发性的呼 Sephrose4FF凝胶层析 ，收集病毒峰。通过 电镜负 吸道 、消化道 、神经系统、皮肤损伤[5]。因此，制备单 染观察病毒形态，并用酶标仪测定病毒 OD值 ，置 克隆抗体可以为犬瘟热的诊断和治疗提供 良好的基 一 8O℃保存备用_6j。 础 。 1．2．2 动 物免疫 免疫 6周龄～8周龄 的雌性 l 材料与方法 Balb／c小 鼠5只 ，免疫共分