狂犬病病毒核酸RT-LAMP检测方法的建立.pdfVIP

中国人兽共 患病学报 108 ChineseJournalofZoonoses 文章编号 ：1002—2694(2O11)02—01O8—04 狂犬病病毒核酸 RT—LAMP检测方法的建立* 黄 元 ，向 华 ，陈 晶，向 蓉 ，张健腓 ，宣 华 摘 要：目的 建立RT—IAMP方法，实现对狂犬病病毒核酸的快速、灵敏、简便 的检测 。方法 针对狂犬病病毒 的核衣 壳蛋 白基 因(N基 因)和大转录酶蛋 白基 因(I基 因)中的高度保守 区段分别设计 了一套引物，建立 了检测狂犬病病毒 的快速一 步式反转录 环介导恒温扩增 (RT IAMP)方法。样 品提取总RNA 后，加入 BstDNA 聚合酶、各种反应成分，于63℃恒温水浴 箱 中放置 60rain，80℃ 5min终止反应 ，加入荧光染料 SYBRGREENI，根据颜色变化 肉眼判定结果。结果 两套引物对狂犬 病病毒RNA进行RTLAMP检测 ，均有 良好的特异性，灵敏度均比RT一巢式PCR高 1o倍 以上 。结论 该方法简单、快速 ，不 需电泳，利用染色剂肉眼判定结果，不需要大型仪器 ，能在 70min内完成对狂犬病病毒 RNA的检测，适用于可疑动物 的快速 检测 ，尤其适合基层使用。 关键词 ：狂犬病病毒；RT—IAMP；检测 中图分类号 ：R373 文献标识码 ：A Reversetranscription。-loop。。mediated isothermalamplification methodforrapiddetectionofrabiesvirus HUANG Yuan，XIANG Hua，CHEN Jing，XIANG Rong，ZHANGJian—fei，XUANG Hua (VeterinaryMedicineInstituteofGuangdongAcademyofAgriculturalSciences，Guangzhou510640，China) ABSTRACT：Detectionofpathogenplaysan importantroleinthecontroltOrabies．Inthisarticlearapidonestepreverse transcription loop—mediatedisothermalamplification (RT—IAMP)techniquewasdevelopedwithtwosetsofprimersaim ingtO theN geneandtheIgeneofrabiesvirusrespectively．BothtWOsetsofprimersshowedfairlygoodspecificityandmorethan 10 timessensitivitythanRT—nestPCR．Thewholeprotocolfinishedin lessthan70rainswithonlyawaterbath．Resultswerede cidedbynaked—eyeswithoutelectrophoresis．ThistechniqueisfitforrapiddiagnosistosuspectableRNA specimenespecially in laboratory lackofspecialequipments． KEY W0RDS：rabiesvirus；RT—IAMP；detection 狂犬病是危害最严重 的人兽共患传染病之一。 位 。因此 ，狂犬病的防控已成为紧迫的任务 。 其病原狂犬病病毒 (Rabiesvirus)，属于弹状病毒科 本文针对狂犬病病毒的核衣壳蛋 白基 因(N基 (Rhabdoviridae)狂犬病病毒属 (Iyssavirus)[1]。狂 因)和大转录酶蛋 白基 因(I基因)中的高度保守区 犬病毒主要通过破损 的皮肤或粘膜进入人体 ，经神 段分别设计了一套引物 ，建立 了检测狂犬病病毒的 经末梢上行进入中枢神经系统。临床表现主要为急 一 步式反转 录一环介 导恒 温扩增 (Reversedtran— 性 、进行性 、几乎不可逆转的脑脊髓炎 。野生动物是