外源基因在噬夏孢欧文氏菌中的表达.pdfVIP

维普资讯 第 2O卷第 2期 青 岛大 学 学 报 (工 程 技 术 版 ) Vol_2ONo．2 2005年 6月 JOURNALOFQINGDAOUNIVERSITY (ET】 Jun．2005 文章编号 ：1006—9798(2005)02—0015—04 外源基因在噬夏孢欧文氏菌中的表达 汪靖超，赵 驰，王 波，杨 宏，李荣贵 (青岛大学理工学院生物系，山东 青岛 266071) 摘要 ：用 CaC1法制备噬夏孢欧文 氏菌 (Erwiniauredovora)感受态细胞，热激处理可使 质粒 pACYC184转入噬夏孢欧文氏菌细胞，转化率为 656cfu／~gDNA，转入的质粒可以 在细胞中稳定存在 ，并随着细胞分裂而复制，质粒上的氯霉素抗性基因在其启动子的控制 下能够高效表达，氯霉素乙酰转移酶可达噬夏孢欧文氏菌菌体总蛋 白的 3O．2696／。噬夏 孢欧文 氏菌可 以作为一种新的原核表达系统 。 关键词：噬夏孢欧文 氏菌；转化；表达 中图分类号：Q786 文献标识码 ：A 原核生物如大肠杆菌、枯草杆菌等因其细胞分裂速度快 ，营养要求低，代谢可控等优点而被广泛用作外 源基因表达的受体细胞。具有限制一修饰系统缺陷的大肠杆菌菌株应用最为广泛，但同时，大肠杆菌菌株也 存在明显的缺点：一是由于其细胞壁中含有 内毒素，因此用大肠杆菌表达的药物蛋 白副作用大；二是真核基 因在大肠杆菌中的表达产物经常以包含体的形式存在，随后的纯化需经过变性复性等过程，从而增加了可溶 性活性蛋 白的纯化难度。枯草杆菌细胞壁中不含 内毒素，并能大量分泌可溶性的蛋白质到细胞外 ，但枯草芽 孢杆菌因分泌大量的蛋白酶而易引起 目的蛋白的降解 。因此，寻找新的外源基因表达系统，在基因工程的产 业化过程中仍是一个具有重要意义 的课题 。噬夏孢欧文氏菌 (Erwiniauredovora)是一种可以合成类胡萝 卜素的细菌u ]，实验中发现 ，常规的大肠杆菌感受态细胞制备方法也适用于噬夏孢欧文氏菌，转化率较高。 本项 目研究的目的拟对噬夏孢欧文氏菌的特性进行研究，并为其成为基因工程新的受体菌提供必要的理论 和实验依据 。 1 材料和方法 1．1 材料与试剂 噬夏孢欧文 氏菌 (Erwiniauredovora20D3(ATCC19321))购 自美 国模式菌种收集 中心(ATCC)，质粒 pACYC184为美国NewEnglandBiolabs公司产品；其他试剂为国产分析纯。 1．2 方法 1．2．1 噬夏孢欧文氏菌的培养 将噬夏孢欧文氏菌接种于LB液体培养基 (蛋 白胨 10g／L，酵母提取物 5g／L，NaC110g／L，pH 7．2)或 LB固体培养基 (LB液体培养基 中添加 1．2 的琼脂)，28℃振荡培养 (液体培养基)或静置 (固体培养基)培 养 。 1．2．2 噬夏孢欧文 氏菌对几种常见抗生素的敏感性分析 取 10 L噬夏孢欧文氏菌菌液 (ODs。。约为 0．5)涂布于含不同浓度不同种类抗生素的 LB固体培养基 上，28℃培养过夜，观察菌落形成情况 ，确定噬夏孢欧文氏菌对不同抗生素的敏感性。 收稿 日期 ：2004—11—15；修 回 日期 ：2005—03—15 基金项 目：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项 目(2oo3) 作者简介：汪靖超 (1973一)，男，山东泰安人 ，讲师，理学硕士，研究方向为分子生物学。 维普资讯 16 青 岛大 学学报 (工程技 术版 ) 第 20卷 1．2．3 噬夏孢欧文 氏菌感受态细胞的制备与质粒转化 噬夏孢欧文 氏菌感受态细胞的制备与质粒转化参照大肠杆菌感受态细胞的制备与转化方法，具体步骤 参照Sambrook等 的方法进行；本实验选用的质粒为 pACYC184，转化菌液加入 4倍体积的LB培养基， 28℃温育 2h后，涂布于含氯霉素 (30t~g／mL)的LB固体培养基上，28℃培养过夜。 1．2．4 氯霉素 乙酰转移酶在噬夏孢欧文氏菌