胶孢炭疽菌侵染柿树的细胞学研究及CGTA1基因的克隆.pdf

致 谢 本论文是在导师张敬泽副教授的悉心指导下完成的。张老师一丝不苟的作 风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，深深地感染和激励着我。从课题的选 择、实验设计和论文的写作，张老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。 两年多来，张老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我 以无微不至的关怀，在此谨向我的导师张敬泽副教授和家人致以崇高的敬意和 诚挚的感谢． 在此，我还要特别感谢徐同老师在学--j、科研和生活中给了我精心的指导． 徐老师高尚的人格和严谨的治学态度是我学--j、生活和工作等方面不断进步源 泉． 感谢谢关林老师、陈卫良老师和王洪凯老师在学-j和实验上的指导，感谢 楼兵干老师在实验材料分析上给予的帮助，同时感谢郑小军老师在显微镜使用 上给予我的指导． 感谢在一起愉快度过研究生生活的孙虎、刘路宁、刘爱荣、姚艳萍、朱洁、 吴晓鹏、刘亚力、屠艳拉、万瑶、李静、张丽丽、谢柳等师兄师姐师妹们的热 心帮助和支持，所取得的每一份收获都包含着你们的智慧与劳动。这里良好的 实验条件、浓厚的学术气氛、团结友爱的精神时刻鼓舞着我，在此表示由衷的 感谢! 感谢我的家人特别是爱人朱利萍对我的理解、支持和无私的奉献． 最后向参加本论文评阅和答辩的专家、教授致以最诚挚的谢意． 李明江 二oO七年十一月于杭州华家池畔 摘 要 柿树炭疽病在全世界产柿国家均有发生。近年来，在浙江淳安地区无核柿 kaki cv．Wuheshi)上柿树炭疽病发病严重，给当地柿树产业发展造成 (Diospyros 了严重损失，成为可持续发展的瓶颈；侵染无核柿的炭疽菌是由胶孢炭疽病菌 Penz．)引起的。病原菌侵染柿树枝条互作过程中， (Colletotrichumgloeosporioides 也发现柿树炭疽菌也具有两种营养阶段，初生菌丝可穿透寄主细胞壁从一个细 胞进入另一个细胞，并且在寄主互作界面上也形成界面基质，非常相似于菜豆 炭疽菌侵染寄主的细胞学特征。炭疽菌为了侵入寄主组织，采用各种侵染策略， 提供了研究真菌致病性的分子和细胞学极好的模式。本文主要说明叶柄和枝条 在不同的发育阶段对炭疽病发生和发展的影响，从细胞学水平上揭示成熟组织 抗病的机制；为了说明胶孢炭疽菌活体营养向死体营养的转换机制，并克隆了 胶孢炭疽菌CG列J『。 1、柿树器官发育对炭疽病发生的影响 通过人工接种柿树炭疽菌在不同发育时期的无核柿叶柄和枝条，证明感病 的无核柿叶柄和枝条随着发育对炭疽病抗性增强，主要表现为病害潜育期延长， 枝条上可推迟40h。侵染过程的细胞学研究表明，接种72h后，在成熟叶柄中 当大的初生菌丝在穿透寄主细胞壁时变细，然后直接穿透寄主细胞壁，又形成 膨大的初生菌丝，并从初生菌丝上产生次生菌丝。比较原先的研究结果认为， 叶柄发育影响了炭疽菌从活体营段向死体营养阶段的转化，使活体营养存在时 间延长，从而也使病害潜育期延长。 2、胶孢炭疽菌CGTAl基因的克隆 ：根据菜豆炭疽的CLTAl基因及其同源真菌锌簇转录因子基因的分析，设计 简并引物，扩增胶胞炭疽基因组DNA获得一个长度为687bp的基因片段。该基 因片段与CLTAl基因对应序列相比，大小仅相差两个碱基，同源性为67．24％， 说明获得片段是目的基因片段。 根据该基因片段设计嵌套的特异引物，用TAIL．PCR方法从胶孢炭疽菌基 因组DNA中扩增该基因片段两端侧翼序列，获得2844bp基因序列。序列分析 表明，该序列是目的基因CGTAl序列，该序列中包含2514bp的完整阅读框，5’ 读框具有65．1％的同源性。BLAST搜索比对认为，该基因同源于真菌锌簇转录 因子基因。 关键词：柿树；胶孢炭疽菌；细胞学；基因克隆； 热不对称交错PCR (TAIL．PCR) 2 Abstract