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差异表达基因克隆技术的新进展 编辑：studa9ngns 作者：佚名 出处：中国论文下载中心 日期：2005-12-15 提要 分离并克隆差异表达基因是目前功能性基因研究的热点。mRNA差异展示是筛选差异表达基因最有 效的技术之一，它的主要不足是有一定假阳性。RDA 、SSH、DSD 、LSH技术能够克服假阳性，但也具有一 定的不足，应根据需要选择运用。随着能扩增长片段及具有自动校正功能的Taq酶出现及应用，这些技术将 会不断完善与发展，具有广阔的应用前景。 关键词 差异表达基因；克隆 现代分子生物学研究表明，人类基因组约由 10 万左右的不同基因组成，这些基因选择性的表达决定了机 体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。因此，分离并克隆差异表达基因不 仅有助于阐明生命的粤秘，而且还能为基因诊断与治疗提供重要的理论依据。近几年来，差异表达基因克隆 技术不断完善与发展，已成为研究肿瘤和疾病等相关基因的重要手段。 一、mRNA 差异展示 mRNA差异展示（mRNA differential display,DDRT-PCR ）是目前筛选差异表达基因最有效的方法之一， 其基本原理是：3´端采用锚定引物，与mRNA3´poly a结合，进行反转录，形成mRNA ：cDNA杂交分子，5´ 端采用 20 条随机引物，与锚定引物一起进行PCR扩增，其产物经测序胶显示出来，再回收鉴定克隆差异条 带。1992 年Liang和Pardee[1]建立此技术时，5´端采用 20 条随机引物，每条由 10 个碱基组成，3´端采用 12 条引物即T12MN(M=A、C或G，N=A 、G、C、T) 。这种组合从统计学上几乎能完全覆盖所有的mRNA序列， 差异表达的基因会全部呈现出来。实践证明，这种方法有效，但假阳性率在 50%～70%左右，差异条带在 Northern 印迹上重现性差，后续处理也比较复杂。1994 年Ito[2]等对 3´端引物进行了改进，把 12 条引物改为 3 条，即T12A、T12C、T12G，使得实验操作简化。1995 年Ayala[3]等提出了在 3´端锚定引物与 5´端随机引 物上皆增加 10 个碱基，使得上下游引物Tm值在 60℃左右，PCR循环参数也改为前 5 个循环采用Liang和Pardee 推荐的参数，即 94℃30s，40 ℃2min,72 ℃30s 。经这样改进，显著地增强了差异条带的重复性和敏感性，同 时使得差异条逼带的克隆十分方便。1996 年 4 月，Liang和Pardee[4]对 5´端此物进行了改进，引物条数改为 8 条，皆带上HindⅢ酶切位点，每条由 13 个碱基组成，3´端锚定引物采用 3 条，也带上HindⅢ酶切位点，每 条由 18 个碱基组成，PCR循环条件仍采用 94℃30s,40℃2min,72 ℃30s,40 个循环，最后在 72℃延伸 7min 。1998 年[5]我们在Liang和Pardee改进的基础上，对PCR循环参数进行了改进，即前 5 个循环采用 94℃30s,40℃ 2min,72 ℃30s,后 35 个循环采用 94℃30s,55℃2min,72 ℃30s，最后在 72℃延伸 7min 。经这样改进，既保持了 扩增效率，又增强了差异条带的特异性及重复性，降低了假阳性率。 总之，mRNA差异展示具有简便、快速、所需起始材料少、同时可在多个材料之间或不同处理材料之间 进行比较等优点，但具有较高频率的假阳性和短小的差异片段的缺点，给后续处理带来一系列问题，虽然此 技术经过了一些起改进，但这两个缺点仍限制着此方法的充分应用。 二、代表性差示分析 代表性差示分析 （representational difference analysis,RDA ）最早由Lisitsyn等提出的。1994 年，Hubank和 Schatz[6]将其应用于克隆差异表达基因，其基本原理是：靶方（Tester,T ）和驱动方（Driver,D ）的cDNA在 进行差方式分析前均用一种识别 4 碱基序列的限制酶作切割处理，形成平均长度为 256b