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PCR 引物设计的11 条黄金法则，及常用软件使用介绍 1.引物最好在模板cDNA 的保守区内设计。 DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI 上搜索不同物种的同一基 因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因 的保守区。 2.引物长度一般在15~30 碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度 大于74℃，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC 含量在40%~60%之间，Tm 值最好接近72℃。 GC 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太 大。另外，上下游引物的Tm 值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定 盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm 值 5~10℃。若 按公式Tm=4 （G+C）+2 （A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm 为55~80℃，其Tm 值最 好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3 位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3 位，因密码子的第 3 位易发生简并， 会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A 时，即使在错 配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T 之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错 误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最 好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3 个连续的G 或C，因这 样会使引物在GC 富集序列区错误引发。 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4 个碱基的 互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer 与 Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4 个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G 值不要过高（应小于 4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能 正常进行。 8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。 △G值是指 DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G 值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对 值不超过 9）的引物。引物3′端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6 软件进行分析） 9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′端决定着PCR 产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影 响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等； 引入蛋白质结合DNA 序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。 10.扩增产物的单链不能形成二级结构。 某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结 构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA 的稳定二级结构，有助于选 择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。 若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP 取代dGTP 对扩增的成功是有帮助的。 11.引物应具有特异性。 引物设计完成以后，应对其进行BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下 一步的实验了。 附： 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC 含量 偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列 相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量