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高效液相色谱法的应用讲座 HPLC 仪器的介绍，基础知识。 HPLC 在各项分析技术中应用，及一些主要的技术要求、技术细节，着重讲解方法认 证的各要素应如何理解和进行试验。并将举更多的实例，使大家对原理和应用有一个 更深的认识和体会。 同时，还将讲述在新药申报和审评中，应注意的问题和事项，并就各剂型的注意事项 逐一讲解。 有关物质的测定方法如何建立，和如何做到更科学、合理地制订一个产品的质量标准， 和今后应如何去完善，修改。 我将还介绍以下Excel 软件在我们分析工作中的应用。 演示一下HP-1100 高效液相色谱仪软件的使用技巧 大家在工作中应经常总结，理论联系实际，重视文献的查询，不要匆匆忙忙地就进行 试验，搞清楚原理，做好试验计划、设计好试验后，再有条不紊地进行。期间不要怕 遇到问题，越是遇到问题，解决问题，提高得越快，如果长时间下来，都没有问题， 都“一帆风顺” ，那将会一直没有提高。这就是同样学历的大学生毕业几年后，水平差 异很大的主要原因所在。建立一新药的质量标准时，可查阅其相关品种（结构式很像 的），或其前几代品种的质量标准（USP 、BP 、JP 等），一定会有所启发和帮助的。 工作的出发点也应一切以工作为主、以人为本！这一点是非常重要的，所有的工作都 应该是有意义的，应把力气花在“刀刃”上。不要片面地追求数量，尽量把每一个工 作把它做透、做明白，力争做到举一反三、融会贯通，这样遇到问题才能够解决。否 则，将会事倍功半。大家应尽量多动脑筋，多思考，如何去提高工作效率，避免人力 和物力的不必要浪费！ HPLC 仪的一般操作 1. 几大仪器生产厂商的介绍和使用下来的体会。 2. 流动相的配制 全部混合好后，泵抽滤、超声。不要用两个泵分别将流动相输入，即 便是带了脱气机也不要这样操作，除非摸索试验条件。另应特别注意，抽滤所采用的膜。 现市场上分别三种：用于水相、有机相，以及混用膜。最好采用混用膜，有一些厂家已发 生将膜使用错，将泵堵塞的情况发生。抽滤后最好能再超声片刻。基线如波动过大，或出 现毛刺基线时，基本上为气泡所至，再进行一遍抽滤和超声脱气。尤其是梯度洗脱时，更 1 应注意气泡的产生。如有两个泵，最好集中使用一个泵，另一个以备用。 3. 柱子的安装 一般都有箭头指向，如无，按照文字方向。 4. 操作顺序 先冲洗外管路，再进柱子，流速应逐渐增加，观察流出情况和柱压。尤其 是厂里质检科，这项工作是十分有意义的。 5. 平衡时间 一般大流速，1 小时即可，测斜率，不看视野，定一常规数值；如有十二烷 基硫酸钠等表面活性剂，可采用小流速冲过夜，第二天再加大流速1~2 小时即可，否则保 留时间将一直变化。 6. 如有气泡，无法实验，不要慌张，可将泵头上的旋扭拧下进行处理（详细讲解）。 7. 仪器维修 最好单位里能培养一位对仪器兴趣的同志，小毛病可自己修理，免去许多 维修费，同时可马上解决问题。 （1）分析生化样品或血液制品时，最好加一预柱，还有用手性色谱柱时，也最好加一预 柱以保护价格昂贵的手性色谱柱。 （2 ）最好能配一柱温箱，以保证试验的重现性和降低柱压以及清洗色谱柱时容易清洗干 净。 （3 ）最好能配一电脑，国产软件4000~5000 即可。数据便于处理，储存。 （4 ）压力不稳时，绝大多数情况是有气泡混入。应排除。 （5 ）试验后色谱柱冲洗。一般采用10%~20%的甲醇水溶液冲洗10~20 个柱体积即可，即 流速为 1.0ml/min，冲洗40 左右即可。冲洗柱子 实验结束后，如有盐，先采用纯水冲洗 15~20 分钟（流速 1.0ml/min），如有十二烷基硫酸钠等表面活性剂，可时间再长一些；然 后用20% 甲醇冲洗10~20 个柱体积，1.0ml/min 流速，1 小时即可，不可冲洗时间过长，相 反会损伤柱子，且不要用纯水长时间冲洗。 （6 ）色谱柱不用、存放时，两头柱塞一定塞住，否则容易挥发干损伤柱子。 （7 ）建立仪器使用登记本，把每次仪器测定地样品名、流动相、柱压、柱温等参数记录 下来，由于测定的品种不多，这就可很好地对仪器进行监控。 HPLC 仪的性能 1．定义 HPLC——high performance liquid chromatography 2 ．分析物