动物分子生物学实验.docVIP

实验一 分子生物学仪器的使用及原理 实验目的 1.学习认识分子生物学实验室的仪器设备 2.了解分子生物学仪器设备使用的注意事项 二、主要仪器设备 普通离心机 无菌操作台 高速冷冻离心机 PCR仪 恒温振荡摇床 真空干燥箱 恒温水浴锅 紫外分光光度计 微波炉 微量移液器 Eppendorf管 高压灭菌锅 电泳仪 凝胶成像系统 紫外仪 三、实验报告要求 写出分子生物学主要仪器设备的使用注意事项 实验二：质粒（pEGFP-N1）的提取与酶切 一. 实验目的了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。二. 实验原理碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。碱性（pH 12.012.5）条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒DNA。三. 仪器设备 微量取液器（2 μL；20 μL；200 μL；1 000 μL），tip头，手掌型离心机，1.5 mL离心管, 恒温水浴，制冰机，超净工作台，恒温培养箱。振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。 四．实验试剂1.溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖；20 mmol/L Tris·HCl（pH = 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH=8.0），高压蒸汽灭菌（121 ℃，0.105 Mpa）20 min。4 ℃贮存。2.溶液Ⅱ（现用现配）：0.2 mol/L NaOH；1 g / L SDS。3.溶液Ⅲ（pH 4.8）：每100 mL溶液中含5 mol/L乙酸钾60 mL；冰乙酸11.5 mL；H2O 28.5 mL。4.RNase（10 mg / mL），LB液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 %（V / V）乙醇，无菌水。五.实验步骤：1) 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3-5mlLB（含氨苄）液体培养基中，37℃振荡培养12-14小时。取上述培养物移入1.5mlep管中，室温以8000r/min离心5分钟，弃上清，再加1.5ml上述养物于ep管中，室温以8000r/min再离心5分钟。弃上清液，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。加溶液Ⅰ100μl，用力弹ep管，使菌体分散均匀；加溶液Ⅱ200μl，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心ep管放置于冰上5分钟，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置10分钟。（溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。）然后，室温以12000r/min离心5分钟。抽取上清液于一新微量离心管（ep管）中，加无水乙醇900μl，冰浴20分钟，室温以13000r/min离心10分钟，放入净化工作台用风机吹干，加TE，定容至30μl，再加RNA酶5μl，37℃水浴30分钟。（-20℃保存备用）1) 制胶：1%琼脂糖电泳：琼脂糖0.5克，TBE50毫升放电炉上使之融化，温度降到50摄氏度时加入EB冷凝后倒胶，30分钟后凝固，拔去梳子。2) 加样：取已转化的感受态细胞溶液10微升，再加5微升上样液。3) 电泳：电压40V和电流50mA 条件下，50分钟后用紫外灯观察（有无条带），若有条带跑出，进行抽提。加TE400微升、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）400微升，用力弹匀。室温下，12500rpm离心10分钟。观察到液体分三层，取上层液于一新灭菌过的EP管中，再加氯仿400微升，然后室温下，12500rpm离心10分钟。取上清液，加无水乙醇900—1000微升、乙酸铵100微升，用力震荡。-20摄氏度下放置1-1.5小时，然后室温下，13000rpm离心5-10分钟。弃去上清液，加75%的酒精混匀。室温下，12500rpm离心5分钟。弃去上清，把EP管放入净化工作台用风机吹干后，用TE定容至30微升。4) 酶切：30微升体系取上述液体15微升，加多组分缓冲液3微升BSA 3微升 灭菌超纯水7微升HINDIII和BamHI 各1微升 以上操作皆在冰上，操作完后37摄氏度水浴3—4小时。 实验三：PCR基因扩增 一、实验目的：通过本实验学习PCR反应的基本原理和试验技术。二、实验原理：多聚酶链式反应的原理类似于DNA的天然复制过程。