胰岛素样生长因子1基因转染脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的研究.pdfVIP

胰岛素样生长因子-1 基因转染脂肪间充质干细胞向软 骨细胞分化的研究 李建军，赵群，王恩波 摘 要：目的观察胰岛素样生长因子-1 （IGF-1 ）基因转染的脂肪间充质干细胞（ADSCs ） 向软骨细胞分化的效果。方法 原代培养兔ADSCs ，免疫荧光法检测细胞表面抗原CD44、 CD49；脂质体介导人IGF-1 基因转染兔ADSCs 联合低浓度血清培养基向软骨细胞分化诱导， RT-PCR 及Western blot 方法检测IGF-1 的表达，MMT 法绘制细胞增殖曲线、甲苯胺蓝染色 软骨结节、免疫组织化学检测II 型胶原的表达。结果 脂肪间充质干细胞CD44 、CD109 表达 阳性，基因转染后细胞IGF-1 表达阳性，细胞增殖速度增快，出现软骨结节，Ⅱ型胶原表达 增高。结论 从脂肪组织中能够分离出增殖旺盛的ADSCs ， IGF-1 在ADSCs 内获得稳定表 达，细胞增殖能力增强，促进其向软骨细胞分化。 关键词：脂肪间充质干细胞，软骨细胞，胰岛素样生长因子-1 ，基因转染，诱导分化 [1] 脂肪间充质干细胞（ADSCs ）是来源于脂肪组织的成体干细胞，具有多向分化潜能 。 胰岛素样生长因子-1 （IGF-1 ）是促进软骨细胞发育的重要生长因子之一，在细胞分裂增殖 及细胞外基质的分泌过程中起重要作用[2] 。本研究旨在探讨采用转基因 IGF-1 的方式诱导 ADSCs 向软骨细胞分化的可能性，为其作为种子细胞应用于关节软骨缺损的生物治疗提供 实验依据。 1. 材料和方法 1．材料与主要仪器 成年新西兰大白兔（中国医科大学实验动物部提供）、I 型胶原酶（Invitrogen 公司）、 Lipofectamine 2000 （Invitrogen 公司）、collagen Ⅱ鼠抗人单克隆抗体（Neumarker 公司）、 pcDNA3.1-hIGF-1 （吉林大学徐莘香教授惠赠） 2 ．ADSCs 的原代培养 取兔颈后皮下脂肪组织，剪碎，0.1%I 型胶原酶37℃消化60min，0.16mol/L NH4Cl 裂 解红细胞，过滤、离心，沉淀悬浮后接种至细胞培养瓶，置细胞培养箱内常规培养。 3 ． ADSCs 表面特异性抗原的检测 取第2 代ADSCs 爬片，4%多聚甲醛固定，一抗鼠抗人CD44 、CD109 单克隆抗体4 ℃湿 盒孵育过夜、二抗FITC 标记山羊抗小鼠IgG 室温孵育2h ，荧光显微镜下观察。 4 ．真核表达质粒pcDNA3.1-hIGF-1基因转染ADSCs 取第2代ADSCs 以0.5×106/孔接种于6孔板，细胞融合至90～95%时随机分为未转染组、 转染空载体pcDNA3.1组及转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组，转染方法按Lipofectamine 2000说明 进行。转染24h后按1 ∶20传代，48h后用含500µg/ml G418的培养基筛选培养，2周后克隆形 成，将其挑至24孔板低血清浓度培养基继续培养，G418 的浓度降至200µg/ml维持筛选作用。 5 ．稳定转染后的鉴定 分别提取各组细胞总RNA ，反转录合成第一链cDNA，以cDNA 为模版PCR 扩增IGF-1 及内参照β-actin，共计30 个循环，1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果。 1 本课题得到教育部博士点基金资助项目（20060159024 ）的资助。 - 1 - 引物序列(合成于Invitrogen 公司) Gene sense primer 5’-3’ A