用凝胶电泳研究发夹型引物检测端粒酶活性3.pdfVIP

二 ○○四年·第四期 研制与开发 用凝胶电泳研究发夹型引物检测端粒酶活性 1 ,2 1 1 1 1 黄艳萍 　孔德明 　柴鼎赓 　沈含熙 　宓怀风 ( 1. 南开大学化学学院 , 高分子功能材料吸附与分离国家重点实验室 　天津 　300071) (2. 天津医科大学药学院 　天津 　300070) 摘 　要 　端粒酶是目前最广谱的恶性肿瘤的预警标志物 , 其活性对大多数恶性肿瘤的诊 断均具有较高的敏感性和特异性。本文针对端粒酶延伸产物序列的特殊性 , 开发一类新 型发夹型引物。该引物具有的发夹结构使得 PCR 扩增只能在加热条件下启动。运用这 项技术 , 建立用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性的新方法。减少非特异性扩 增产物及引物二聚体的生成 , 提高检测的专一性。将该法用于恶性肿瘤细胞提取物中端 粒酶活性的检测 , 取得满意的结果。 关键词 　非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳　发夹型引物　端粒酶　聚合酶链式反应　基因检测 止端粒酶延伸产物在此端的延伸 , 避免了假阳性结 引言 果的出现。因而得到广泛的应用 , 但该法在不进行 端粒酶是一种独特的具有逆转录酶功能的核糖 热启动的条件下 , 存在非特异性扩增产物的干扰。 核蛋白酶 , 主要功能是合成端粒重复序列 ( 5’ - 在 ACX 引物的基础上 , 设计出一个新的发夹型引 GGTTAG- 3’) 并维持端粒序列长度 ( 10～50kb) 。 物 ACXM , 该引物具有的发夹结构使得 PCR 扩增只 由于其在良性肿瘤和正常细胞中几乎无活性, 而在 能在加热条件下启动。运用这项技术 , 建立一种用 大多数恶性肿瘤细胞中均能检测到其活性。因此 , 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性的新方法 , 并 端粒酶被公认为是目前最广谱的恶性肿瘤的预警标 以人工合成的不同长度的端粒酶延伸产物为检测对 志物 , 其活性对大多数恶性肿瘤的诊断均具有较高 象 , 对该法在提高检测专一性方面的效果进行了研 1 究 ; 同时 , 将该法用于恶性肿瘤细胞中端粒酶活性 的敏感性和特异性 。检测端粒酶活性的“端粒重 复扩增法” (telemetric repeat amplification protocol , 的检测取得满意的结果。 TRAP) 2 , 是评估端粒酶是否为肿瘤标志物的重要 1 　实验部分 手段。最初的 TRAP 法分为三步 : 第一 , 端粒酶以 自身 RNA 的片段为模板 , 在作为端粒酶底物 11 　仪器与试剂 ( ) (telomerase substrate , TS) 的寡核苷酸链的末端添加 PCR 热循环仪 英国 , Hybaid Limited , TGL -