第四章聚合酶链式反应.pptVIP

⑤引物的Tm值 Tm=（G+C)?4 + (A+T)?2 当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC。 适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。 实际复性温度选择低于Tm值5 oC。 手工计算： 一般估计： ⑥引物的浓度 一般使用终浓度各0.2?mol/L。 ⑦简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。 设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。 引物设计现在多用专业软件 ⑧套嵌引物（nested primers) 1 3 2 4 如Primer5.0等 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失 dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性 （3） dNTP （4）模板DNA 但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量： 不能太多，100?l反应体系中100ng足够。 ① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 （5） Mg2+ ① 一定范围内提高退火温度； ② 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及 多余的DNA聚合酶参与酶促延伸的机会； ③ 降低引物和酶的浓度可以减少错误引发， 尤其是能减少引物二聚体的引发； ④ 改变Mg2+的浓度； 4.7 提高PCR扩增的特异性 ⑤ 引物设计的特异性； ⑥ 减少循环次数； ⑦ 热启动（Hot Start） ⑧ 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来 提高扩增的特异性。 典型的引物1５到30个核苷酸长 ； 选择GC含量为45％到55％碱基的分布是随机的； 避免引物间和引物内产生４碱基以上互补； 避免3‘末端的错误配对； 设计5‘端和中间区为G或C的引物； 避免引物对3‘末端存在互补序列； 避免3‘末端富含GC，设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。 避免存在可能会产生内部二级结构的序列。 4.7 引物设计的基本原则： 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物量：每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmolRT-PCR 引物设计特别注意：跨越两个外显子 附加序列:目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5’端而不影响特异性。 引物5′端修饰技术 修 饰 法 用 途 附加核酸序列： 酶切位点 克隆（如定向克隆） 噬菌体启动子 合成RNA探针、测序 蛋白质结合序列 产物纯化、检测 核糖体结合序列 高效表达 其它 构建载体、重组子等 4.8　聚合酶链式反应技术类型 巢式PCR： 是为了增加扩增的灵敏度,对已知序列设计出第一对引物,扩增25个循环,然后根据序列设计第二对引物(在第一对引物内部),如此扩增,不受平台效应限制,灵敏度高。 选定一个温度范围，如50——35，每个温度2循环，然后在35度15循环。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火温度时比较适合。 降落PCR 竞争引物PCR ： 有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。 不对称PCR 低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。 3’ 5’ 5’ 3’ 引物少 用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。 技术关键： 两个引物的浓度相差100倍。 锚定PCR： 锚定PCR是在未知DNA cDNA片段的一个末端人工接上一个已知序列片段,利用一个基因特异引物与这个人工序列区引