山羊类ES细胞的分离和培养.pdfVIP

细胞工程与转基因 山羊类ES细胞的分离与培养 刘艳1，黄海军2，高其双2，蒋思文1 1+农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室农业部猪遗传育种重点开放实验室，华中农业大学，武汉430070： 2’武汉市农业技术科学院畜牧兽医所生物技术实验室，武汉430065 关键词：胚胎干细胞；内细胞团：分离：传代；山羊 引言 steincells，ESCs)是由附植前早期胚胎内细胞团(innercellmass，ICM)或附植 胚胎干细胞(embryonic 后胚胎原始生殖细胞(primordialgerm 了ESCs系，如牛、猪、大鼠、兔、恒河猴以及人类等。对于山羊来说，至今还没有ESCs成功建系的报道。 本试验以6～7d的囊胚和桑椹胚为材料，对其在体外培养时的增殖及其影响因素进行了研究，探索适用于山 羊类ESCs生长和传代的条件。 材料方法 对12只武汉本地白山羊分三次进行超排处理，配种6～7d后，采用外科手术法取胚胎。第1批胚胎分3 组，接种到3种饲养层细胞上：④小鼠胎儿成纤维细胞；②山羊胎儿成纤维细胞；(耍)C2C12细胞。第2批 胚胎分3组，采用3种培养方法：①全胚培养，等其发育为孵化囊胚后，在普通培养基中分割胚胎，以后每 次都用此法传代；②全胚培养，等其发育为孵化囊胚后，在10倍浓度的LIF和SCF中分割胚胎，以后每次 都用此法传代；③将胚胎在酶中作用5～8rain后，借助玻璃针除去透明带，在10倍浓度的LIF和SCF中分 离ICM。第3批胚胎，全胚培养至孵化囊胚阶段，然后采用酶消化和机械分离相结合的方法处理胚胎，再将 胰岛素；③20％FBS+LIF+SCF+胰岛素+肝素。 结果 试验结果表明：①与MEF相比，GEF更有利于山羊类ESCs的贴壁，但是在促进细胞增殖方面，却没有 明显的差别，都传至第4代；而C2C12与前两者相比，更有利于细胞贴壁，但却不利于维持细胞未分化状态， 传至第3代细胞已分化完全。②将胚胎全胚培养至孵化囊胚阶段再对细胞进行处理，有利于细胞的增殖；而 对ICM进行分离时，在高浓度细胞因子LIF和SCF中进行，更有利于维持细胞的未分化状态，细胞传至第8 代。③与培养基中只添加LIF和SCF(传至第4代)相比，培养基中添加肝素和胰岛素更有利于细胞的生长 (传至第9代)④对山羊类ESCs进行碱性磷酸酶活性鉴定，碱性磷酸酶呈阳性。 讨论 体外培养饲养层细胞是为了模拟体内附植环境，提供ESCs体外存活、增殖所必须的一些生长因子，本试 增殖速度过快，用丝裂霉素C处理时，要延长处理时间(4--一4．5h)。处理ICM时，在高浓度细胞因子L腰和 SCF中对其分割，更有利于细胞维持未分化状态，这可能得益子LIF对ESCs的抑制分化作用。而在山羊类 ESCs的培养基中，添加肝素，可以促进细胞的增殖，这可能是由于肝素可以和一些肝素结合型生长因子，如 成纤维细胞生长因子相结合，促进细胞增殖。本研究结果为以后建立山羊类ESCs系，提供了～些参考。 致谢 本研究受到国家“863”项目(2007AAl00505)资助。 ·一185-一