大肠杆菌aroL基因敲除及其对莽草酸合成的影响.pdf

第 46 卷 　第 3 期 复 旦 学 报 ( 自然科学版) Vol.46No.3 2007 年 6 月 JournalofFudanUniversit y (NaturalScience ) Jun.2007 　　文章编号 :0427 7104 (2007) 大肠杆菌aroL 基因敲除及其对莽草酸合成的影响 付小花 ,高益范 ,郝思捷 ,张伯生 ,任大明 (复旦大学 生命科学学院 遗传学研究所 ,遗传工程国家重点实验室 ,上海 200433 ) α ( ) 摘 　要 : 以 E . coli DH5 基因组为模板克隆莽草酸激酶 Ⅱ基因 aroL ,构建质粒 pMDaroL, 经 Hpa Ⅰ、BsaB Ⅰ ( ) λ 酶切后插入卡那霉素抗性基因 kan 得 pMDaroL::kan, 利用 pKD46 的 重组系统 ,用该质粒上的 kan 及两端 的aroL 同源序列替换 E . coli Top10F ′基因组上的 aroL 基因 ,再运用质粒 pCP20 编码的 FLP 重组酶消除 kan 基 因.Southernblot 证实基因敲除是成功的 ,测序结果表明 kan 已经从基因组上消除 ,摇瓶发酵显示构建的基因工 程菌的莽草酸产量是原始菌株的 1.57 倍. 关键词 : aroL ; 基因敲除 ;Red 重组系统 中图分类号 : Q96 　　　　　文献标识码 : A ( ) 　　莽草酸 shikimicacid 是芳香族氨基酸和芳香维他命的生物合成通路 ———莽草酸途径的重要中间 体[1] . 它具有众多生理功能 :通过影响花生四烯酸代谢来抑制血小板聚集 ,从而可以抑制动 、静脉血栓及 脑血栓形成 ;具有抗炎 、镇痛作用 ;还可作为抗病毒和抗癌药物的中间体 ,有广泛的药用价值[2] . 莽草酸还 ( ) 是可以抑制 H5N1 型禽流感病毒的药物磷酸奥司米 oseltamivir phosphate, 商品名达菲 的原料 ,随着禽流 感疫情在全球蔓延 ,莽草酸更加供不应求. 虽然莽草酸途径在植物、微生物和寄生生物中广泛存在 ,但该途径的中间代谢物 ,如莽草酸、奎尼酸等的 [3] 大量生产却并不容易 , 目前主要是从八角属植物果实中提取莽草酸 ,但是提取工艺繁琐 ,且成本较高 . 因此 利用微生物发酵生产是解决此问题的最佳方法 ,但我国目前还没有可以发酵生产莽草酸的菌种. 莽草酸激酶催化莽草酸磷酸化为 3磷酸莽草酸的反应. 大肠杆菌中有两个莽草酸激酶 , 即:莽草酸激 酶 Ⅰ和莽草酸激酶 Ⅱ,分别由 aroK 和 aroL 编码. aroL 编码的莽草酸激酶 Ⅱ是大肠杆菌中起主要作用的 酶 ,其 Km 值比莽草酸激酶 Ⅰ小约一百倍[4] , 由于莽草酸激酶 Ⅰ的 Km 值大 ,底物莽草酸必须累积到一定 浓度该酶才能起作用 ,所以在大肠杆菌中催化此反应的酶主要是莽草酸激酶 Ⅱ. 本文利用近年来发展起来 的基因敲除方法 ———Red 重组系统[5] ,用构建的内部带有抗性筛选标记 、两端为靶基因同源序列的线性片 段 ,替换基因组上的 aroL 基因 ,获得具有卡那霉素抗性且 aroL 基因敲除的菌株. 1 　材料与方法 1.1 　菌株与质粒