DNA重组技术概述.pptVIP

基因表达的分子生物学基础 质粒DNA的提取及鉴定 1．收获细菌 2．碱裂解法小量抽提质粒 　　（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。 　　（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。 　　（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。 　　（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。 　　（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀 　　（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀DNA，室温放置2min。 　　（7）4℃以12000g离心5min。 　　（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。 　　（9）用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。 　　（10）加50μl的1×TE（含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶），振荡，贮存于-20℃。 聚合酶链反应（PCR） Polymerase Chain Reaction 基本原理： 变性、 退火、 延伸 大肠杆菌感受态的制备 （1）接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。 （2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。 （3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。 （4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl2 5ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。 （5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl2 1.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。 重组DNA的转化 （1）将3只Eppendorf管按下列组作好标记，然后按下述进行： 转化组：受体菌＋重组DNA 阴性对照组：受体菌 阳性对照组：受体菌＋阳性DNA 　　 （2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。 （3）42℃90s。 （4）37℃水浴5min。 （5）加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。 （6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。 感受态细胞：指具备接受外源DNA能力的宿主细胞 导入大肠杆菌 1. 氯化钙转化法 2. 电击法 3. 体外包装感染法 导入哺乳动物细胞 1. 显微注射法 2. 电穿孔法 3. DNA-磷酸钙共沉淀 4. DEAE-葡聚糖转染法 5. 病毒感染法 6. 脂质体介导法 7. 细胞融合法 8. 原生质体融合法 9. 微细胞介导法 一、重组DNA技术相关概念 （一）DNA克隆 克隆（clone） 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,即无性繁殖。 技术水平： 分子克隆（molecular clone） 即DNA克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） 内切核酸酶 内切核酸酶 ，维持细菌遗传性状的稳定。 　　限制性内切核酸酶或DNA结合蛋白所特异识别、结合的DNA位点的核苷酸序列，呈二元旋转对称，通常将这种特殊的结构顺序称为回文结构（palindrome）。 识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷酸；产生的切口可以是粘性末端、平头或钝性末端、配伍末端。 。 ５’ ５’ ３’ ３’ ５’ ５’ ５’ ５’ ５’ ５’ ５’ ５’ ３’ ３’ ３’ ３’ ３’ ３’ ３’ ３’ (三)目的基因? 目的基因：用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA(target DNA)。 类型： cDNA(complementary DNA)：指经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA，经聚合可合成双链cDNA。 基因组DNA(genetic DNA)：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 大容量载体 柯斯质粒载体 酵母人工染色体载体 * * DNA重组技术概述 天津科技大学：罗学刚 第一节 DNA的重组 DNA Recombi