外源性 Nkx2.5、GATA4促进大鼠骨髓间充质干细胞的心肌分化.pdf

2015年07月 中国民康医学 Jul,2015 第27卷 半月刊 第14期 Medical Journal of Chinese Peoples Health Vol.27 Semimonthly No.14 【发育生物学】 Podocan在牛骨骼肌卫星细胞中的作用及调控 李 爽,刘 丹,佟慧丽,张伟伟,严云勤* (东北农业大学细胞生物学教研室,黑龙江省 哈尔滨 150030) 【摘要】 目的:细胞外基质(ECM)在细胞发育,组织修复,调控细胞增殖、分化、粘附和迁移方面具有十 分重要的作用。 小的富含亮氨酸的重复蛋白(SLRP)家族属于细胞外基质中的一类重要的非胶原蛋白。 Podocan,是一个大约由600个氨基酸组成的分泌蛋白,属于SLRP家族中的第五亚类蛋白。 Podocan在肾脏、 心脏、肝脏、胰腺和血管的平滑肌细胞中均有表达,其对平滑肌细胞的迁移和增殖具有负调控作用,可以调节 内膜的增生。 本实验室在前期研究工作中通过对牛骨胳肌卫星细胞增殖分化过程的高通量测序结果表明, Podocan在牛骨胳肌卫星细胞中具有一定的表达,随着卫星细胞的分化,其表达量呈显著增加,推测其能够 参与牛骨胳肌卫星细胞的分化,与牛肌肉的发育和成熟具有密切关系。 方法:本研究以体外培养的牛骨胳肌 卫星细胞为实验材料,以2%马血清分别诱导细胞分化2d、3d、4d和5d。 收集细胞,采用荧光定量RT-PCR 和Western Blot 的方法分别检测不同分化程度的牛骨胳肌卫星细胞中Podocan mRNA 和蛋白的表达水平。 通过免疫荧光染色的方法检测Podocan在细胞中的表达定位。 此外,本研究构建Podocan 的过表达载体以及 shRNA干扰和CRISPR干扰载体,以脂质体2000 的方法转染骨骼肌卫星细胞,分别实现Podocan 的过表达和 抑制,以荧光定量RT-PCR和Western Blot 的方法检测Podocan 的过表达和抑制效果,同时检测骨骼肌卫星 细胞分化的标志基因MyoG(Myogenin)和MyHC(Myosin Heavy Chian)的mRNA 和蛋白表达水平变化。 结 果:随着牛骨骼肌卫星细胞分化的进行,Podocan 的mRNA 和蛋白表达量显著增加,免疫荧光定位结果显示 其主要分布在成熟的在肌管的细胞中,而未分化的细胞其表达量较低。 Podocan 的过表达和抑制载体能够 显著增加或抑制其在牛骨骼肌卫星细胞中的表达量,且 MyoG和MyHC mRNA 和蛋白表达水平的检测结果 显示,Podocan 的表达增加和抑制能够促进或减少骨骼肌卫星细胞分化的程度。 结论:Podocan在牛骨骼肌 卫星细胞的分化过程中具有重要的调控作用,其促进肌肉分化的分子机制深入探索能够为肌肉生长发育机 理的研究及提高肌肉产量的肉牛生产提供帮助。 *通讯作者 詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬詬 【发育生物学】 外源性 Nkx2.5、GATA4促进大鼠骨髓间充质干细胞 的心肌分化 * 陈 炜,张 雷 ,尹 青,张金平,赵秀军,赵春芳,张亚楠 (河北医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室,河北 石家庄 050017) 【摘要】 目的:心脏早期转录因子Nkx2.5、GATA4 转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),探讨 Nkx2. 5、GATA4对大鼠BMSCs 向心肌细胞分化的作用和影响。 方法:全骨髓法分离、纯化、扩增培养SD大鼠BM- SCs,流式细胞术联合检测第三代细胞表面分子,CD90+/ CD29+/ CD45-细胞达95%以上。 采用阳离子转染 TM 试剂Lipofectamine 2000将pEGFP-N1-Nkx2.5、pVP22-GATA4/ myc-His质粒转染BMSCs。 结果:转染4周 后,Western blotting、免疫细胞化学结果表明,与空质粒组、空白对照组相比,Nkx2.5、GATA4 显著提高转染组 大鼠心肌细胞肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cT