浅谈PCR方法中常见的污染问题及对策.pdfVIP

网址：/ 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、 敏感、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一 根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定， 所以近年来RT-PCR 技术被广泛应用于人和动物的多种传染病早期诊断。笔者一 直从事实验室动物疫病检测工作，现就应用RT-PCR 实验方法过程中出现的一些 常见污染问题做如下论述，仅共同行参考和探讨。RT-PCR 实验有三步：提取RNA、 反转录（RT）、PCR 扩增及扩增产物分析，在这一过程中，最令人头痛的问题是 易污染，极其微量的污染即可造成假阳性。污染原因主要有以下几个方面： 1、样品间的交叉污染收集样品的容器最好使用一次性的，如重复使用， 应在使用前应于 180℃的高温下干烤6 小时或更长时间；样品存放时要密封 严实，以防外溢造成相互间的交叉污染；样品在提取过程中离心管及吸样枪 头最好使用一次性的，以免不同实验样品间相互污染；由于吸样枪污染会导 致样品间的污染，也是一个值得注意的问题，由于操作不慎将样品或提取物 吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取时要十分小心， 吸时要慢，吸取尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶 污染；同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管，开盖时也容易造成气溶胶 污染。若产生气溶胶较多，会造成环境污染，不仅会导致实验失败，而且也 会损害操作人员身体健康，因此每次实验完毕都要及时清理实验台面，用0.5% 次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。 2、RT-PCR 本身使用的试剂污染在试剂配制过程中，由于加样枪、容器 及其它溶液被污染。因此所有试剂都应尽量小量分装，以减少重复加样次数， 避免污染机会，另外 RT-PCR 试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕 后同样要进行台面消毒和紫外线照射消毒。 3、扩增产物的污染这是实验中最常见的问题，极微量的扩增产物污染 就可造成假阳性，每次实验完后，扩增产物都要及时密封后处理。在做RT-PCR 实验时，一般都应设阳性对照，操作不慎，污染可能性很大，因而当某一 RT-PCR 试剂经自己使用稳定，检验人员经验丰富心中有数时，在以后的实验 中可免设阳性对照，或间隔性设阳性对照，以减少污染机会。 4、操作人员污染只要存在少量的RNA 酶就会引起RNA 的降解，从而影 响结果的准确性，RNA 酶可存在操作人员手汗、唾液中，也可灰尘中，一旦 器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成实验失败，因此操作人员应 戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换，。设置 PCR 操作专用 实验室，所用实验用具应为专用，并合理分隔实验室，将样品的提取、配制 RT-PCR 反应液、PCR 循环扩增等步骤分室进行，实验前应将实验室及实验人 员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的DNA 或RNA。任一种科学的实验 方法都有其自身完善和发展的过程，RT-PCR 方法也不例外，在检测质量能保 证的情况下，若能简化样品提取步骤或缩短其时间，减少扩增循环次数，都 能对防止污染有利。总之，RT-PCR 不管从特异性方面还是从灵敏性方面讲都 具有难以匹敌的优势，结果的可靠性和可信性应该是最好的，是较具权威性 的检测方法，我们期待着它能尽快地自身完善和发展。