实时荧光定量RT-PCR检测石斑鱼病毒性神经坏死病.pdfVIP

陈信忠等：实时荧光定量RT-PCR检测石斑鱼病毒性神经坏死病 实时荧光定量RT．PCR检测石斑鱼病毒性神经坏死病① 陈信忠② 龚艳清 王 军③“ 苏永全” (厦门出入境检验检疫局 厦门361012) (。厦门大学海洋与环境学院厦门361005) 摘要 用TaqMan探针技术设计探针和引物，建立了检测石斑鱼神经坏死病毒(NNV)的 实时荧光定量RT-PCR方法。对影响PCR反应的主要因素Mg+浓度和退火温度进行了 优化，表明当Ms+浓度为3，0～3．5mM，退火温度为58～59。C时可获得最佳的扩增和检 lanceolatus)NNV主衣壳蛋白基因组片段构建的噬菌 测效果。应用鞍带石斑鱼(Epinephelus 体假病毒作为阳性质控品，具有很好的稳定性。鞍带石斑鱼NNV的检测试验表明，所建 立的实时荧光定量RT．PCR方法是检测石斑鱼神经坏死病毒的一种快速、灵敏、准确的检 测方法。 关键词 神经坏死病毒，TaqMan探针，实时荧光定量RT．PCR，石斑鱼 准确的特点而在人类和畜禽等传染病的诊断中得到 0 引言 越来越多的应用，但在水生动物传染病的检测上应 鱼类病毒性神经坏死病(viralnervousnecrosis， en． VNN)又称病毒性脑病和视网膜病(viral and cephalopathy retinopathy，VER)，是世界范围的一 spotsyndrome 种鱼类流行性传染病，对仔鱼和幼鱼危害很大，严重 荧光定量技术中常用的TaqMan探针技术，建立了 者在一周内死亡率可达100％，对成鱼也有很高的 致死率。由于其极高的传染性和危害性，被国际兽 NNV的检测中取得了很好的效果。 疫组织(OIE)列为重要的鱼类病害¨J。导致该传染 necrosis 1 材料与方法 病的致病原为神经坏死病毒(nervousvires， NNV)，是罗达病毒科(Nodaviridae)的一种小RNA病 1．1实验材料 毒。Yoshikoshi等于1990年首先报告了日本条石鲷 神经坏死病毒阳性的病鱼为福建漳浦县某育苗 (Oplegnathus fasciatus)中的罗达病毒，并将该传染病 场的鞍带石斑鱼鱼苗，该批样品经RT-PCR方法检 称之为病毒性神经坏死病[2J。至今已有报告的受该 测证明NNV阳性。活体采集实验用鱼，全鱼冻存于 病危害的鱼类包括鳗鲡目、鲈形目、鲽形目、纯形目、 鳕形目中的40余种。上世纪末，我国台湾人工养殖 的多种石斑鱼暴发流行VNN导致大批死t213J。本 9700PCR仪为美国PE公司产品。 世纪初，广东海水养殖的石斑鱼也发生VNN，造成 大批仔鱼死亡【4j。近几年在我国南方各省养殖的各 阳性质控品采用假病毒技术克隆的含石斑鱼 种石斑鱼常常暴发流行VNN，给石斑鱼养殖业造成 很大的经济损失15J。由于目前对VNN尚无有效的菌体。MS2噬菌体由厦门大学李庆阁教授的实验室 防治措施，若能建立一种能够快速、灵敏、准