TGF-β1基因修饰兔B型滑膜细胞复合Pluronic-F127构建组织工程软骨实验研究.pdfVIP

TGF．p1基因修饰兔B型滑膜细胞复合 Pluronic．F127构建组织工程软骨的实验研究 专 业：骨外科 硕士研究生：宋斌 导 师：李卫平副教授 摘 要 目的 B 体外分离培养兔B型滑膜细胞(typesynoviocytes)，构建转化生长因子 factor pl(transforminggrowth ．TGF．131质粒，用脂质体法将该质粒转染兔B型滑膜细胞，将转染后细胞复合 Pluronic—F127在裸鼠体内构建组织工程软骨，观察转染后细胞体内向软骨组织 方向分化的可行性，为基因加强组织工程学修复软骨损伤提供实验依据。 方法 1、取3月龄健康新西兰大白兔，雌雄不限，耳缘静脉注射空气处死，严格消 毒下，迅速开腹切取小块肝脏组织，置入冻存管，立即投入液氮中冷冻备用；同 时打开膝关节，用眼科镊撅取关节腔内面的滑膜组织，将术中取到的组织迅速带 入无菌室，分别应用酶消化法行滑膜细胞体外培养扩增，贴壁筛选、单一胶原酶 消化和多次传代法相结合行纯化培养，同时进行抗Vimentin、抗CD68免疫组化 鉴定细胞。 2、取出液氮中冷冻的肝脏组织，研磨成粉末，Trizol法提取总RNA，分析 TGF．13 131 扩增；将带有pcDNA3．1(+)的菌株行扩增、摇菌、抽质粒，将扩增后I均TGF DH5a感受态 3．1(+)进行酶切，将目的片段连接载体，转化E．coli eDNA和pcDNA 细胞，鉴定转化菌，Amp筛选，对阳性菌克隆提质粒，进行酶切鉴定，将阳性 菌液送测序鉴定。 3、转染前一天，取第三代滑膜细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，接种于6孔 2000试剂 板，每孔细胞数为2x105，待细胞生长至80％融合时，按lipofectamine 盒说明行pcDNA3．1一TGF 染，上述两组分别为实验组和对照组，以软骨细胞为阳性对照组。实验组、实验 对照组转染后48d,时行G418筛选阳克隆，每两天取部分细胞做细胞计数，连续 12天，绘制细胞生长曲线，取部分阳性细胞行RT．PCR检测TGF．131、II型胶原、 糖氨多糖的瞬时表达，对RT—PCR结果用Scnlmage软件分析处理，计算相对灰度值， 所有实验数据使用SPSS13．0行统计学处理，各间两两比较，采用方差分析，P值 O，05有统计学意义；另取部分阳性细胞做细胞爬片，4％多聚甲醛固定后行TGF 0l、II型胶原免疫组织化学染色。 定表达的细胞进行混合，同时取软骨细胞混合Pluronic—F127、空载体转染细胞 混合Pluronic—F127作为对照组，各组细胞浓度均为5x107／mL的复合物，迅速以 0．2ml注射器行裸鼠背部皮下注射，分别在术后4、6、8周处死实验裸鼠，取出裸 u 鼠背部组织进行大体标本观察后，制成5 m厚切片，切片行苏木素一伊红(HE) 染色光镜下观察骨组织及软骨组织形成情况，同时进行抗Il型胶原、抗TGF—B1 免疫组织化学检测。 结果 l、兔滑膜来源的B型细胞体外分离培养，细胞呈梭形和多角形，活性良好， 细胞可传代10代而无明显退变迹象，进行免疫组化鉴定，抗Vimentin为阳性、抗 CD68为阴性，可与A型滑膜细胞鉴别。 2、成功构建真核表达载体pcDNA3．1一TGF131，质粒酶切后电泳显示有 pcDNA3．1和TGFpl片段，测序结果完全符合TGFB1DNA序列。 3、脂质体法转染后，生长曲线显示转染后细胞生长活性较阳性对照组降低， 实验组细胞转染后第3天，RT．PCR检测到TGF B1、II型胶原、糖氨多糖阳性片 段，实验对照组为