十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶(AdMn-SOD)生物信息学分析、表达及其活性研究.pdfVIP

十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶(AdMn．SoD)的生 物信息学分析、表达及其活性研究 摘 要 【目的】 本论文在课题组前期分离获得十二指肠钩虫锰超氧化物岐化酶 信息学分析；进一步构建AdMn．SOD成熟蛋白原核表达系统，在大肠杆菌 度、pH值对活性的影响。研究结果将为进一步研究AdMn．SoD的生物学功能并 探讨其应用奠定基础。 【方法】 1．AdMn-SOD的生物信息学分析 运用生物信息学软件DNAS吖皿及DN触以AN分析前期获得的AmI．SOD 基因序列的阅读框(OI谭)；运用在线软件Si铲alIP3．0及TargetPprogram 细胞定位；运用在线生物信息学软件BLAST搜索An由叶SOD基因序列及其推 AdMn．SOD的功能域；运用CUJSTALW程序比对分析An缸．SOD与其它已报 道线虫及部分代表性物种的Mn．SOD氨基酸序列；运用MEGA3．1软件中邻近 法(I溉gll_bor-joining 它线虫及部分代表性物种Mn．SOD的进化树关系。 2． AdMn-SOD的原核表达 I和 设计引物，扩增Ad№．SOD成熟蛋白编码序列，扩增产物经M Z砌饥II双酶切后与表达载体pET．32a连接，构建重组原核表达重组质粒。将构建 导表达，SDS．PAGE分析表达情况。 3．重组AdMn-SOD的活性检测 诱导表达的重组蛋白用Ni亲和层析进行纯化，用Bradf．0rd法测定纯化蛋白 的浓度，用超氧化物岐化酶检测试剂盒wsT-l检测重组蛋白AdMn．SOD的超氧 化物抑制百分率，测定其酶活性的单位，并分析温度、pH值对活性的影响。 【结果】 1． AdMn．SOD的生物信息学分析 推导AdMn-SOD 肽。AdMn．SOD包含有保守的与锰离子结合的3个组氨酸残基及1个天冬氨酸残基 构。AI舭卜SOD前端20个氨基酸残基组成信号肽序列，第2l一216个氨基酸序列为 其蛋白序列；经用Targ卯预测，AdMn．SOD位于线粒体中。 用BLASTN及BLASTP程序在GellBank中检索相似性序列，结果显示 Ad№．sOD基因序列及其推导的编码蛋白与秀丽小杆线虫、罗氏沼虾 Ⅲ删砒幽f删脚明6孵的及中国对虾(砌刀e唧册口邮幽加伽话)等线粒体 M小SOD具有较高相似性。与其它线虫及部分代表性物种的Mn．SOD氨基酸序列 亲缘关系较近。 2． AdMn-SOD的原核表达 运用RPPCR技术扩增获得了AdMn-SOD的成熟蛋白编码序列，并成功构 建了pET32a／Ad№．SOD原核表达重组质粒。构建好的重组表达质粒 的重组AdMnSOD可溶性目的融合蛋白量达44．4nlg／IIll。 3．重组AdMn．SOD的活性检测 mg。pH值在6．5和9．5之间对其活性影响不大，其最适pH为8．5；随温度的升 高，其活性逐渐降低，在90℃仍存在40％以上活性，因此可知重组AdMn．SOD 对温度有较好的耐受性，在较高温度仍具有较好的酶活。 2 【结论】 Mn．SOD亲缘关系较近，与其他生物种Mn．SOD序列也具有较高相似性；成功 AdMn．SOD具有较好生物活性，结果为进一步研究AdMn．SOD的生物性功能和 特性奠定了基础。 【关键词】：十二指肠钩虫，锰超氧化物岐化酶，生物信息学，原核表达，活性， pH，温度 Bioinformatic and Ancylostoma acti、ri锣of analysis，expression duodenale manganesesuperoxide Abstract Objective To bioinformaticsofme dismut勰e a11alyze predictedmaIlg髓ese哪I锄xide