四环素诱导de丙型肝炎病毒非结构蛋白5b稳定细胞株de构建和检测.pdfVIP

． 84． 生 壁 !rD ! ! 堕 ! !鱼 坠：塑 !j ． ： ： · 论 著 · 四环素诱导 的丙型肝炎病毒非结构蛋 白5B稳定细胞 株的构建和检测 王耀辉 ，丁焕平 ，王熵婵 ，袁正宏 。’。 1．复旦大学上海医学院教育部／卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 200032；2．复旦大学生物医学研 究院，上海 200032；3．上海市 (复旦大学附属)公共卫生临床中心，上海 201508 摘 要：丙型肝炎病毒 (HCV)感染个体后在宿主细胞内长时间保持低水平复制 ，与慢性肝炎、肝硬化及肝细 胞肝癌的发生密切相关。目前，HCV感染后肝细胞发生转化的具体机制还不清楚。非结构蛋白5B(NS5B) 是HCV编码的非结构蛋白之一，具有 RNA依赖的RNA聚合酶活性 (RdRp)，是病毒复制所需的关键酶。 除参与病毒复制外，NS5B通过直接与宿主蛋白相互作用影响细胞的正常功能逐渐成为人们关注的焦点。为 深入了解NS5B在病毒复制和致病过程中的作用 ，本研究在肝癌细胞系HepG2细胞中构建了可由四环素诱 导 (Tet—On)的NS5B稳定细胞株。结果显示，与对照组相比，加入四环素可成功诱导NS5B。加入不同浓度的 四环素或经过不同的诱导时间，目的蛋白均能同时被标签抗体和抗NS5B抗体检测。免疫荧光法进一步证实 NS5B存在于细胞质内。本研究所构建的NS5B稳定细胞株可用于诸多后续试验，为深入研究NS5B的功能 提供了细胞模型。 关键词：丙型肝炎病毒；非结构蛋白5B；HepG2；Tet—On Establishmentand detection ofa tetracycline—inducible stable celllineexpressinghepatitisC virusnonstructuralprotein5B WANG Yao-Hui，DING Huan-Ping ，WANG Yu．Chan ，YUAN Zheng—Hong。 j．KeyLaboratoryofMedicalMolecularVirology，MinistryofEducationandHealth，ShanghaiMedical College，Fudan University，Shanghai200032，China；2．Institutesof BiomedicalSciences，Fudan University．Shanghai200032，China；3．ShanghaiPublicHealthClinicalCenterAffiliatedtoFudan University，Shanghai201508，China Abstract：HepatitisCvirus(HCV)infectioniSamajorriskfactorofchronichepatitis，livercirrhosis，and hepatocellularcarcinoma(HCC)．However，thedetailedmechanism ofactiononcancercausedbvHCV iS stil1elusive．Nonstructuralprotein5B (NS5B)iSoneofthenonstructuralproteinsencodedbyHCV andiS essentialforHCV RNA replication due to itsRNA-dependentRNA polymerase (RdRp) activity．In additiontoparticipatinginviralRNA replication，NS5Bwasalsofoundtobeinvolvedinthepathogenicity 0fHCV throughadirectinteraction withhostproteins．InordertoaddresstheroleofNS5B inHCV replicationandpathogenicity，weconstructedatetracycline—inducible (Tet—On)stablecelllineexpressing NS5B inHepG2cells．Protein expressionwasexaminedbyW esternblotusingboth