PCR技术应用三突变基因检测.pdfVIP

中国试剂网 3.9.52 PCR 技术应用三：突变基因检测 基因突变(genemutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶 性 肿瘤发生有关的突变基因(mutantgene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究 的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有 重要 ＼意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR 技术的出现及近年来以 PCR 技术为基础， 结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、 准确的基因分析途 径，并取得了令人瞩目的成果. 基因突变是癌基因激活，抗癌基因失活及遗传病发生的根本原因，从广义的 角度 来看，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变三种形式，只是它 仍所涉及的 范围不同，后两种基因突变涉及的基因较多，可通过光学显微镜分 析细胞有丝分裂中 期的染色体而检出.亦可在间期用标记探针检出，点突变通常 的涉及的范围较少，它 是肿癌和遗传病发生的主要分子改变，因此，它是基因 分析的主要研究内容.不同类 型的基因突变有不同的检测途径，大致方法包括： 应用基因探针直接检测；应用PCR 技术检测；利用探针技术进行分析。 PCR 在突变基因检测时的应用 利用核酸探针及 Southern 印迹杂交技术进行基因突变分析时由于诸多限制 难以满 足这际工作的需要，自从 PCR 技术问世以来，建立于 PCR 技术基础上 的突变基因检测技 术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而 且即使获得极微量的组织 亦可经 PCR 扩增而进行中种检测，加上 PCR 技术与 探针杂交技术，RFLP 技术及 PCR 直接 测序的结合，改换方法得以迅速发展和 推广，大大的促进了遗传病及肿瘤有关的基因 的研究进展. 一、点突变的 PCR 直接检出 (一)用 PCR 直接检测缺失: 当基因内缺失时，可用已知的该基因DNA 序列在缺失片段的两侧设计一对 引物， 然后进行 PCR ，对其产物行琼糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外检测仪下 检测有无特异 性的扩增产物，即可非常容易的判断待检称本中有无 DNA 片段 的缺失. 1.一对引物 PCR 检测缺失如果一个基因的 DNA 序列已经清楚，其缺失部位 亦较为固 定，即可根据缺失发生区域的 DNA 序列在缺失片段的两侧合成一对 中国试剂网 3.9.52 合适的引物进行 PCR ， 然后琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色，短波紫外灯下观察 有无特异性的扩增片段，该方 法是检测基因片段缺失最为快速的方法，在实际 应用中，为了避光因某些原因引起的 扩增失败而导致假阴性结果的出现，常在 反应体系中加入一对与缺失片段无关的基因 引物，同时加以扩增，以确定无特 异性扩增带并非因反应体系的原因的引起.如在应 用 PCR 技术进行X 地贫 Bartα 基因胎儿水肿综合征义基因缺失检测时，常用一对引物扩 增缺失区域，同时同 一对 β 基因引物扩增 β 基因的一个片段，然后电泳检测.若同时 即有 α 和 β 基因 的特异性扩增产物，则说明 α 基因的扩增产物则说明模板 DNA 中有 α 基因的缺 失，为 Bart 胎儿水肿综合征. 2.多对引物的多重 PCR 检测缺失：对于某些遗传病的致病基因来说，其缺 失具有明显的异质性，即在不同患者其缺 失片段有所不同，因而难以用一对缺 失部位的引物将所有的缺失检出，在这种情况 下，我们可设计多对引物检测该 基因的不同外显子区域，即用同一PCR 体系扩增多个 外显子然后用琼糖凝胶电 泳检测有无缺失的片段，若某一特异性的扩增产物带缺如， 则可判定为该片段 的缺失，该检测方法是对已知结构基因有无缺失片段的最快速可行 的检测途径， 目前已用于多种遗传病基因缺的检测.如在 DMD/BMD 缺失型突变的检测 中， 用 23 对引物分为三组进行多重 PCR 可改 98%的缺失得以检出，另外还有人用 9 对物 进行两组多重 PCR ，大约可检出DMD/BMD92% 的缺失型突变. 3.用 PCR 技术进行杂合性丢失的检测：有报道，