体外温热刺激对脐静脉血管内皮细胞活力、增殖及凋亡影响的实验研究.pdfVIP

[1] 础与临床产生了较大影响,并受到了国际医学界的关注 。既往这方面的研究几 乎都集中在中医中药研究的领域,迄今很少见到针 活血化瘀的实验研究报道 [2] 。近些年有少量研究动物的在体实验研究，研究认为其作用途径与艾 热效应 改善血液流变性、纠正血瘀时自由基代谢的紊乱、调节血管的舒缩活动、抑制炎 性细胞因子释放、增强机体免疫功能、改善微循环、调整体液因素和中枢神经递 [3] 质水平、促进内环境的稳定等多环节、多靶点的整合作用有关 。灸法热刺激有 活血化瘀作用，该作用可能是灸疗防病治病取得疗效的一个重要途径和基础,但 其作用机制尚不清楚。开展灸疗活血化瘀作用机制的研究，能为灸法治疗痹证、 脑卒中后遗症、肿瘤等提供实验和科学的 据，对进一步阐明灸疗防病治病的实 质有重要的意义。本课题应用人脐静脉血管内皮细胞为实验模型，模 灸法温热 刺激,观察热刺激对腧穴相关血管内皮细胞生长活力、增殖与凋亡、以及血管新 生的特异性细胞因子等方面的影响，以探讨艾 活血化瘀作用的机制。 1 材料与方法 1.1 实验材料 （1）细胞来源 原代人脐静脉内皮细胞为实验室分离培养，无菌剖腹产新生儿脐 带来自贵阳中医学院第二 属医院妇产科。 （2）仪器 TE2000—S 倒置荧光显微镜 （日本尼康）；W-G-IH 洁净工作台 （上海 博讯实业有限公司医疗设备厂）；USA3131 CO2 细胞培养箱 (美国热电)； ELX808TM 酶标本振荡器 （江苏太仓）。 （3）试剂四甲基偶氮唑盐 MTT250mg（solarbio）；二甲基亚砜、胎牛血清（FBS）、 青霉素和链霉素，购自博大泰克公司；PBS 缓冲液(保存于4℃冰箱备用)，新 生牛血清 （杭州四季青生物工程材料有限公司；M199培养液 （赛默飞世尔生物 化学制品（北京）有限公司）；胰酶细胞消化液（Beyotime）编号CO201，100ml。 TGF- β酶联试剂盒。 1.2 细胞分离、培养及传代[4] 脐带组织取至于贵阳中医学院第二 属医院妇产科排除早产、传染病、羊 水Ⅲ度污染等，健康产妇足月剖腹产新生儿脐带。无菌条件下用PBS 液冲洗脐 带外血迹。剪除脐带两端的钳夹部分，找到脐静脉管腔，用磨平的60 ml 注射 器针头插入管腔，接着用止血钳夹闭针头端，用注射器吸入含双抗的PBS 冲洗 129 液冲洗至清亮为止。用止血钳夹闭另一端，用 20ml 的注射器注入预热好的 15-20ml 用 0.125% 胰 蛋 白 酶 与 0.02% 乙 二 胺 四 乙 酸 （Ethylenediaminetetra-aceticacid，EDTA）混合液，灌入脐静脉使血管充盈， 消化10-12min（期间用手指在脐带外面不停按摩），收集消化液，10%的胎牛M199 u u 培养液(含20%胎牛血清 （Fetal Bovne Serum，FBS），100 /ml 青霉素，100 /ml 链霉素)终止消化。然后移入离心管中，在低速离心机中以 1000r/min，离心 8min，然后弃去上清液。加入含体积分数为20%胎牛血清的M199 培养基，用1ml 2 的移液枪吹打成细胞悬液然后接种于25cm 培养瓶中，置于37℃，5% CO ，饱和 2 湿度的培养箱中培养。24h 后更换培养液通过倒置显微镜形态观察。每天在倒 置相差显微镜下观察细胞贴壁、生长情况照相记录。细胞贴壁后每隔2-4d 更换 一次培养液。 1.3 细胞形态学与标志物鉴定Ⅷ因子鉴定 倒置显微镜下观察细胞的形态并摄片；另外取第二代脐静脉血管内皮细胞 消化制备成细胞悬液，接种于六孔板中的血盖片上，贴壁取出血盖片，用 PBS 冲洗3 次，5min/次，加4%多聚甲醛固定10min，再用PBS 冲洗3 次，5min/次。 加0.25%TritonX-100，放于37℃恒温箱孵