头针对急性脑缺血再灌注大鼠BrdU%2fnestin表达的实验研究.pdfVIP

[2] 回( dentate gyrus, DG) 等，是神经干细胞的主要分布区 。内源性神经干细胞 (neuron stem cells, NSCs)通常处于静息状态，在一定的生理或病理刺激下被激活。 研究表明，脑缺血损伤能促使特定生发脑区内源性神经干细胞增殖、迁移、最终 分化为终末神经细胞，但新生的神经细胞数量少且替代能力不足，而使用某些干 [3] 预措施可起到促进作用，改善某些功能缺损症状 。头针治疗缺血性脑卒中以其 独特的功效受到医学界人士的广泛关注，其疗效在临床和实验研究中得到反复验 证[4，5] 。本研究从头针对BrdU 、nestin 表达的影响出发，从其促进内源性神经干 细胞再生的角度，探讨头针治疗缺血性脑卒中的作用机理。 1 材料和方法 1.1 实验材料 （1） 实验动物 健康 wistar 雌性大鼠（SPF 级）70 只，体重为（200±20g ）， 由湖北省实验动物中心提供[SCXK(鄂)2004-0007] 。 （2 ） 主要药品与仪器 甲醛溶液及水合氯醛购自上海试剂一厂。cy3 羊抗兔 IgG 和 FITC 羊抗鼠 IgG 购自三鹰生物科技有限公司，hoechst33258 和防淬灭剂 封片购自碧云天生物技术研究所。5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)液 购自美国 sigma 公司，其单克隆抗体、神经巢蛋白（nestin ）单抗购自美国 santa cruz 公司。28 号 1 寸华佗牌不锈钢针灸针由苏州医疗用品有限公司制造，LH202H 型 韩氏穴位神经刺激仪购自北京华威有限公司。 1.2 实验方法 （1） 动物分组 按随机分组原则将 70 只大鼠分成假手术组（10 只）、模型组 （30 只）、头针组（30 只）三组，其中，模型组和头针组再根据缺血再灌注时 间的不同，随机分为 7d、14d、28d 共 6 个亚组，每组 10 只。 （2 ） 动物模型制备 参照 Longa 等[6]报道的线栓法，加以改进。以 10%水合氯 醛 （30mg/kg 体重）腹腔麻醉后，在大鼠颈部正中切口暴露右侧颈总动脉 （CCA ）， 分离出颈内动脉（ICA ），颈外动脉（ECA ）。以动脉夹阻断 CCA 血流，再在 ECA 残端剪 0.2mm 的小口，插入直径约 0.22mm、长为 60mm 的尼龙线。轻推 尼龙线端经 CCA 分叉部沿 ICA 入颅，至大脑中动脉（MCA ），遇阻即止，尼龙 线插入深度约（18±0.5）mm 。结扎 ECA 残端口，缝皮。缺血 1h 后，轻轻外拉 尼龙线，至有阻力感时提示尼龙线头部已离开 ICA 而位于 ECA 残端，将体表外 212 的尼龙线剪断，恢复大脑中动脉的血供，实现再灌注。缝合切口后，动脉保温喂 养，并观察造模大鼠生命指征。 （3 ） 治疗方法 头针选穴依据《头针国际标准化方案》，选取顶颞后斜线，顶 [7] 颞前斜线。大鼠穴位定位根据华氏等介绍的大鼠穴位图谱 ，模拟人体经穴定位。 用 28 号 1 寸华佗牌一次性不锈钢无菌针灸针，进针深度约 0.5cm，进针后接韩 氏治疗仪，疏密波，频率2Hz/100Hz, 强度 2mA ，每次 20min ，每天 1 次。 （4 ） BrdU 标记法 各组大鼠于处死前 1 天腹腔注射 BrdU(50mg/kg) ，每2h 注 射 1 次，共注射 4 次，最后一次注射结束 24h 后处死动物。 （5 ） 标本的采集与处理 各组动物在规定时间的治疗观察完成后，于再灌注后各时间点将大鼠用 100g/L 水合氯醛腹腔注射(300mg/kg)麻醉，用多聚甲醛经心脏灌注固定，取脑后 固定24h ，待用。免疫荧光检测步骤如下：选择含侧脑室嘴侧及海马齿状回的脑 组织连续 6μm 冠状切片，①常规脱蜡至水；②切片入 3%H O - 甲醇室温下孵育 2 2