原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法.pdfVIP

中国试剂网 3.18.13 原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法 原位杂交组化 （ISHH ）与免疫组织化学 （IHC ）结合法是先后用 ISHH 和 IHC 在同一切片或两个相邻切片进行染色，这样就可以同一细胞中显示出某种 mRNA 和相应的蛋白、多肽或其它抗原，从而可更好地了解某一基因的转录和蛋白、多 肽合成的动力学。ISHH 与 IHC 结合法可以在相邻切片上分别进行 ISHH 和 IHC 染色，也可先后在同一切片上进行 ISHH 和 IHC 染色。前者可使 ISHH 和 IHC 染色都获得理想的结果，易成功，但易产生空间误差和样本误差。在同一切片上 进行结合法可克服这些误差，但第一次染色总要或多或少地影响第二次染色，使 第二次染色不十分理想。由于 m RNA 易被染色过程中污染有少量 RNase 的液体 所降解，因而在实践中往往首先进行原位杂交组化染色，这种次序使结合法易成 功。但在操作方法中应注意减少生物活性肽或蛋白的丢失，如在杂交后冲洗中适 当减低漂洗温度。 一、同位素原位杂交组化与免疫组化 PAP 法的联合程序 （1）切片入PBS 冲洗 5min，最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。 （2 ）0.1mol/L 甘氨酸 PBs 5min 。 （3 ）0.4%Triton X-100 PBS 15min 。 （4 ）1μg/ml 蛋白酶 K ，37℃保温 30min 。 （5 ）4%多聚甲醛 PBS 固定 5min 。 （6 ）PBS 冲洗 2×3min 。 （7 ）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。 （8 ）2×SSC 冲洗 10min。 （9 ）杂交：如是cDNA 探针用前需进行变性处理，载片法时将切片在空气 中晾干，加含探针的杂交液 10μl 于切片上，盖上 22×22mm 的硅化盖片或相当大 小看蜡膜，3H 标记探针每 10μl 杂交液含 1×105cpm 探针，32P 或 35S 标记探针 每 10μl 杂交液含 5×105cpm 探针；如是漂浮切片，则用灭菌吸水纸将切片水份尽 量吸干，然后入杂交液，探针浓度和载片法一样。入杂交液后 43 ℃保温 12～16h。 （10）4×SSc 37 ℃冲洗 10～30min 。 （11）2×SSC （如为RNA 探针则含 20μg/ml RNase ）37℃冲洗 30min 。 （12）1×SSC 和 0.1×SSc 37℃分别冲洗 30min 。 中国试剂网 3.18.13 （13）PBS 冲洗 2×5min 。（转录ISHH ） （14）0.5%H2O2 PBS 室温 30min 。 （15）1%BSA 37℃，30min 。 （16）第一抗体，4 ℃孵育 16～24h 。 （17）PBS 冲洗 4×5min 。 （18）第二抗体37℃，1h。 （19）PBS 冲洗 3×5min 。 （20 ）兔PAp 37 ℃，1h 。 （21 ）PBS 冲洗 3×5min 。 （22 ）DAB 显色液 5～10min （DAB 显色液：0.05%DAB + 0.03% H2O2 PBS 液配）。 （23 ）PBS 冲洗 3×5min 。如是漂浮切片则将其贴于涂有粘附剂的载片上， 晾干。 （24 ）切片入70%，85%，95%和 2 个 100%酒精脱水，空气干燥。 （25 ）在暗室涂布乳胶（乳胶配制：乳胶原液：0.6mol/L 醋酸胺=1 ：1），晾 干，装入自显影暗盒。 （26 ）4 ℃曝光：3H 标记探针 4～8 周，35S 标记探针 1～4 周，32P 标记探 针 7～10 天。 （27 ）D196 显影液，20 ℃显影 5～10min。 （28 ）自来水冲洗数秒。 （29 ）F5 坚膜定影液 10min。 （30 ）自来水冲洗 15min。 （31 ）切片温箱烤干，脱水，透明，封片。 结果：蛋白或多肽免疫反应阳