双萤光素酶报告基因检测(靶基因验证)实验报告.pdfVIP

合同号：HY-XXXX 双萤光素酶报告基因检测 （miRNA 靶基因验证）实验 和元生物技术 （上海 ）有限公司 ，2013 年 4 月 21 日 摘要 ：本实验使用双萤光素酶报告基因检测系统验证 hsa-mir-21 对目的基因 Tropomyosin 1 （TPM1 ）的抑制作用； 通过检测带有 TPM1 的 3’UTR 的 luciferase 在 hsa-mir-21 过表达时的表达情况，同时结合带有突变预测结合位 点的 3’UTR 的 luciferase 的表达，进一步确定了 hsa-mir-21 与 TPM1 靶基因 3’UTR 的作用位点。 关键词 ：hsa-mir-21 ，3’UTR ，Tropomyosin 1 （TPM1 ），Dual-Reporter Assay 1.实验原理: 萤光素酶是理想的报告基因，因为哺乳动物细胞中不含内源性萤光素酶，一旦转录完成 立刻就生成功能性的萤光素酶。单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告 基因则通过共转染的 “对照”作为内参为试验提供一基准线 ，从而可以在最大程度上减小细 胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响 ，使得数据结果更为可信。Dual-Luciferase 双 萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶 ，两者没有种 源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。得益于超强的光信号和超高的信噪比， 本系统被广泛用于 miRNA 靶基因验证。 由于 miRNA 主要通过作用于靶基因的 3’UTR 起作用，可以将目的基因 3’UTR 区域 构建至载体中报告基因 luciferase 的后面， 通过比较过表达或者干扰 miRNA 后，报告基 因表达的改变（监测萤光素酶的活性变化 ）可以定量反映miRNA 对目的基因的抑制作用； 结合定点突变等方法进一步确定 miRNA 与靶基因 3’UTR 的作用位点。 2.实验目的: 验证 hsa-mir-21 与靶基因 Tropomyosin 1 3’UTR 是否发生作用并进一 步确定 hsa-mir-21 与靶基因 Tropomyosin 1 3’UTR 的作用位点。 3.实验材料 1. 质粒与细胞株 pMIR-对照质粒（和元生物）；pMIR-TPM1-WT 野生型 3‘UTR 实验质粒 （和元生物 ）； pMIR-TPM1-MUT 突变型 3‘UTR实验质粒（和元生物 ）；pRL-CMV（E2261 ，Promega ）； 293T 细胞株来源于 ATCC ，细胞培养条件为 DMEM+10% FBS+5% CO 。 2 2. 实验试剂 lipofectamine 2000（11668-019, invitrogen ）; 胎牛血清(FBS)（SV30087.02 ，Hyclone ）； DMEM （12800-017 ，GIBCO ）；胰酶（Trypsin-EDTA ）（11668-500 ，Invitrogen ）； 24 孔板（3524 ，Corning ）; miR-X mimics（和元生物 ）；Dual-Luciferase Reporter Assay System （E1910 ，Promega ）；Opti-MEM （31985-062, invitrogen ）。 3. 仪器设备 荧光显微镜（IX71 ，奥林帕斯）；CO2 培养箱（3111 ，Thermo ）；生物安全柜（BSC -Ⅱ-A2 ， 上海净化）；低速离心机（TDZ4-WS ，上海湘仪 ）；血球计数板 （REICHERT ，Bright-Line ）； 水浴锅 （HWS12 ，上海一恒 ）；酶标仪（Infinite M1000 ，TECAN ） 4. 统计学处理 GraphPad Prism （Ver5 ，GraphPad Software ）作图 ，并进行双侧 t 检验。 4.实验步骤 实验共分以下 3 个主要步骤 ： 1. 质粒转染细胞 ；2. 双报告基因检测；3. 统计学分析。 1.质粒转染细胞 ： (1) 细胞铺板 ：将细胞按 70%的汇合度接种到 96 孔板。 (2) 转染 ：16 小时后